当归总苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤的改善作用

宋书辉，于 冰，徐 旭，赵专友，汤立达

(1.天津药物研究院释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300193;2.天津中医药大学研究生院，天津 300193)

当归为伞形科植物当归〔Angelica sinensis(Oliv.)Diels〕的干燥根，味甘、辛、性温，是常用活血化瘀中药，现代药理学研究证明其对心脑血管系统和血液系统具有广泛的药理效应[1－2]。当归，素有“十方九归”之称，至今仍广泛应用于临床，相关研究已证实当归具有抗血小板聚集作用[3－5]。大量的研究表明，当归对缺血组织有保护作用[6－11]。当归在扩张血管、抗血小板聚集、保护血管内皮细胞、抗氧化、清除自由基和改善血液流变学等方面具有良好的药理作用[12]。血塞通为已经上市的并且在活血化瘀、通脉活络、抑制血小板聚集和增加脑血流量方面的疗效在临床上已得以验证与肯定。本研究通过对当归主要有效成分当归总苯酞(A.sinensis total phthalide，ASTP)药理作用的探讨，观察其在大鼠脑缺血再灌注损伤方面的作用，以便为临床应用提供依据，并以血塞通为阳性对照药，主要用于对实验方法学的验证以及与ASTP在大鼠脑缺血再灌方面的疗效进行比较和评价。

1 材料与方法

1.1 药品和主要仪器

当归是由天津药物研究院中药现代研究部按照2010年版《中国药典》一部当归质量标准检验，符合规定。每20 g当归生药材能够提取1 g ASTP，以1%吐温-80配置成所需浓度的乳浊液，供大鼠灌胃用。血塞通，云南白药集团文山七花有限责任公司产品，批号20091121，规格:每粒50 mg。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，Sigma公司产品，批号71K1225，以磷酸盐缓冲液配制2%溶液供脑组织染色用。高分子右旋糖酐，相对分子质量50万，中国医学科学院血液病研究所科技公司产品，批号100608，白色粉末，以生理盐水制成10%浓度供动物静脉注射造型用。异氟烷，分析纯，每瓶100 ml，山东科源制药有限公司，批号:20100214。吐温-80，成都市方舟化学试剂厂，化学纯，批号:20090903;丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所;PK121R低温冷冻离心机，意大利ALC公司产品。COOLPIX955数码相机，日本尼康公司产品。病理图像采集与分析系统，北京航空航天大学图像中心产品。

1.2 动物和暂时性脑缺血再灌注模型的制备

雄性SD大鼠，250～260 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号 SCXK(京)2007-0001。

60只SD大鼠，分为6组，每组10只，假手术组、模型组、阳性药血塞通 0.05 g·kg－1组、ASTP 0.05，0.1 和0.2 g·kg－1组。假手术组和模型组分别ig给予1%吐温-80乳浊液，给药体积均为10 ml·kg－1，ig给药，连续7 d。于第7天给药30 min之后，进行暂时性局部脑缺血模型的制备。雄性 SD大鼠，250～260 g，用 24%水合氯醛(350 mg·kg－1，ip)麻醉，之后将大鼠仰卧固定，沿颈部正中作2 cm长的皮肤切口，分离出右侧颈总动脉并穿线2根备用。再分离出颈外动脉，在颈外动脉下方小心分离出颈内动脉及翼突腭动脉，将一根直径0.21～0.23 mm的尼龙线从颈外动脉插入，于分叉的分支处结扎即完成手术。若要进行再灌注，则将尼龙线往回抽至颈外动脉处即可实现再灌[6]。

1.3 神经功能行为学评分、脑梗死面积和脑水肿的测定

分别于再灌前、再灌2和24 h进行神经功能行为学评分[13]。评分后处死大鼠，取出全脑，冠状面间隔2 mm均匀切片6片，间隔取出大脑切片4片放入2%TTC染液中，进行染色。取大脑切片1片以“重量求面积法”计算出梗死组织重量占全脑重的百分比作为梗死面积的比例[9]。再另取大脑切片1片称重后，置于50℃烘箱中烤至恒重，称量其干重，计算大鼠大脑含水百分率(%)=(新鲜脑重－干燥后脑重)/新鲜脑重×100%，脑水肿抑制率(%)=实验组大脑含水百分率－模型组大脑含水百分率/模型组大脑含水百分率×100%。

1.4 MDA含量和SOD活性的检测

按照MDA和SOD试剂盒的说明进行测定。

1.5 大鼠脑膜血管流量测定

动物分组及给药方法同1.2。于第7天给药后1 h，ip给予20%乌拉坦(1 g·kg－1)麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，立体定位于AP3，MR3。切开颅骨顶部皮肤暴露颅骨，用一大小约0.5 cm×0.5 cm的薄膜贴于颅骨上，其上方置激光探头，调节探头高度及位置，使血流量达到65～80多普勒流量单位(PU，ml·min－1)，稳定20 min，记录流量作为基础值。然后经股静脉推注10%高分子右旋糖酐5 ml·kg－1造成微循环障碍;正常对照组不造型，只推注等量的生理盐水。记录推注10%高分子右旋糖酐后5，10，15，20，30，45，60，90和120 min的血流量值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 当归总苯酞对脑缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响

表1结果显示，再灌前，模型组及各给药组神经功能行为学评分均显著高于假手术组(P＜0.01)，给予ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1神经功能行为学评分显著低于模型组(P＜0.05)。再灌2 h 后，ASTP 0.05，0.1和0.2 g·kg－1神经功能行为学评分分别降低 15.5%，28.7%和29.9%，再灌24 h后，神经功能行为学评分分别降低11.9%，25.3%和37.4%，差异有统计学意义(P＜0.01)。阳性对照药血塞通也能明显改善神经功能障碍，与 ASTP 0.2 g·kg－1相当。

Tab.1 Effect of Angelica sinensis total phthalide(ASTP)on neurological score in ischemia/reperfusion(I/R)rats

2.2 当归总苯酞对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积的影响

图1和表2结果显示，与模型对照组相比，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1可明显缩小脑缺血再灌注损伤所致的大鼠脑梗死面积，分别缩小41.7%和49.6%(P＜0.05)，ASTP 0.05 g·kg－1无明显作用。

Fig.1 Effect of ASTP on cerebral infarction rats.A:sham group;B:model group;C，D and E:ASTP0.05，0.1 and 0.2 g·kg－1groups;F:Xuesaitong group.The normal tissue showed red after staining while the part of infarction showed white.

Tab.2 Effect of ASTP on rate of cerebral infarction area in I/R rats

2.3 当归总苯酞脑缺血再灌注大鼠脑水肿的影响

表3结果显示，假手术组脑含水百分率为(76.3±1.1)%。与模型组相比，大鼠给予 ASTP 0.1和0.2 g·kg－1，每天1 次，连续7 d 后，可不同程度减轻脑水肿，分别减轻42%和52%(P＜0.05)，阳性对照药血塞通使脑水肿减轻 39%(P＜0.05)。但仍旧明显高于假手术组(P＜0.05)。

2.4 当归总苯酞对脑缺血再灌注大鼠脑脂质过氧化的影响

表4结果显示，与假手术组相比，模型组MDA含量明显增加，而SOD活性明显下降，表明大鼠脑缺血再灌注损伤后引发明显脑脂质过氧化反应。ASTP可明显降低MDA生成，同时SOD活性有所增加;与模型对照组比较，MDA最大降低幅度达62%，SOD活性最大升高幅度达77%。

Tab.3 Effect of ASTP on brain edema in I/R rats

Tab.4 Effect of ASTP on malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in I/R rats

2.5 当归总苯酞对高黏滞血症大鼠软脑膜微循环的影响

图2结果显示，造模后5 min开始，模型组PU值明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，给ASTP 0.05 g·kg－1组在造模后60 min开始PU值明显升高，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1组从30 min 开始明显升高(P＜0.05)，但均低于同一时间点假手术组PU值。造模后5～30 min期间，ASTP各组PU值明显低于假手术组(P＜0.01)，从60 min开始逐渐恢复，说明给予ASTP对改善脑膜微循环有一定的作用。

Fig.2 Effect of ASTP on pial vascular blood flow(PU)in rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

本研究结果发现，大鼠给予ASTP后，可以缩小造模导致的脑梗死体积，减轻脑水肿，改善软脑膜微循环。当归具有广泛的药理作用，具有补血理气之功效，其作用范围涉及机体的多个系统，当归可以通过改善血栓素A2与前列环素之间的平衡，提高血栓素A2与前列环素的比值，抑制血小板释放5-HT[14－15]。研究结果发现，大鼠脑 MDA 含量降低，SOD活性增加。文献报道，当归具有抗氧化与抗衰老作用，可明显提高D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠大脑皮质SOD活性，提高Ca-ATP酶的活性，降低脂褐素含量[16－17]。说明 ASTP 通过抗氧化作用减轻脑缺血再灌注的损伤。

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