金纳米粒子对CHO-K1细胞毒性的谷胱甘肽作用机制

李武珊，陈丽君

(山东大学齐鲁医院妇产科，山东济南 250012)

纳米材料和纳米技术在生物医学领域的应用是目前研究的热点，金纳米粒子(纳米金，gold nanoparticles，AuNP)通常指直径为1～100 nm 的金颗粒，AuNP在水中因为静电作用可形成稳定存在的胶体状态，因此也称胶体金(gold colloids)。AuNP具有表面积大，易被活性基团修饰和吸收红外线而发热等物理和化学特点，金纳米粒子不仅在电子、催化等科技领域广泛应用，而且被越来越多地应用于生物检测、医学成像、药物和基因运输以及肿瘤治疗等生物医学研究领域[1－5]。如抗原抗体反应中以AuNP作为标记物，可应用于免疫学、病理学和细胞生物学的诊断和检测[1，6];在肿瘤诊断和治疗方面，靶向标记的AuNP可用于细胞成像，明显提高肿瘤检测的灵敏度[7－8];AuNP可以增强肿瘤细胞对放疗的敏感性[9－10];AuNP吸收红外线而产热的特点被用于肿瘤的光热疗法，采用红外照AuNP可升高特定部位细胞的温度而发挥杀肿瘤细胞作用[11];AuNP可以装载抗肿瘤药物，红外线照射可控制释放药物[12－14];表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗体、葡萄糖和叶酸修饰的AuNP可靶向结合于肿瘤细胞，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路和方法[9，15－16]。

随着AuNP在生物医学领域的广泛应用，需要系统地评价AuNP的生物安全性，因此，众多研究者致力于研究AuNP对细胞和动物的毒性，但是目前研究结果不一致，通常认为AuNP的毒性与其颗粒大小、形状、表面修饰物以及实验细胞类别有关[1，17－18]。如体外细胞实验中，AuNP 对白血病细胞和小鼠巨噬细胞没有体现出毒性[19－20]，而在人肺成纤维细胞实验中发现，AuNP可引起细胞的氧化应激和自我吞噬反应[21]，1.4 nm的AuNP可引起宫颈癌细胞坏死，而15 nm的AuNP对宫颈癌细胞几乎没有细胞毒性[22]。动物实验中，一般认为AuNP的生物兼容性比较好，静脉注射的AuNP可以被有效地排出体外[1]，但是也有研究发现AuNP可引起肝急性炎症[23]。另有研究发现，采用灌胃给予AuNP比静脉注射引起的毒性大，可明显引起动物体质量减轻等不良反应[24]。文献对金纳米粒子的生物毒性研究，多停留在表面现象的观察上，对于其作用机制知之甚少，AuNP进入细胞后，细胞中何种物质做出主要反应，尚缺乏有力的实验数据。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳动物细胞和组织中表达的一种三肽类化合物，在肝中表达最为丰富，GSH在细胞和机体内功能之一是解毒，如清除活性氧和解毒重金属化合物，从而保护机体免受环境中一些致病因子的损伤[25－27]。AuNP由金原子组成，GSH是否对AuNP诱导的细胞损伤具有保护作用值得探讨。

本研究采用中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1研究直径为13 nm的AuNP的毒性作用和GSH对细胞的保护作用，为下一步动物实验及临床评价提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1，购自中国科学院细胞库。F12K培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司，丁硫氨酸-亚砜亚胺(L-buthionine-sulfoximine，BSO)、还原型 GSH，TRITC-鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)购自美国Sigma公司，JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、GSH检测试剂盒购自碧云天生物技术公司，直径13 nm的AuNP由山东大学化学院丁轶课题组提供。倒置显微镜为日本Olympus公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品，激光扫描共聚焦显微镜为德国Zeiss公司产品。

1.2 细胞培养

含 10%胎牛血清、谷氨酰胺 2 mmol·L－1、青霉素100 kU·L－1、链霉素 100 mg·L－1的 F12K 培养基，培养环境为37℃培养箱，饱和湿度，5%CO2，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代细胞。

1.3 MTT 法检测细胞存活率[28]

细胞接种于96孔板中，培养过夜，弃去原培养液，加入含有 AuNP 10，20，50 和 100 μmol·L－1的培养基，培养72 h，加入MTT母液，使MTT浓度为0.5 g·L－1，37℃中孵育 3～4 h，弃去原培养基，加入200 μl DMSO，混匀，酶标仪下检测570 nm处的吸光度(A570nm)，以对照组为参考，计算各组存活率。存活率(%)=(A实验组/A对照组)×100%。

1.4 倒置显微镜下观察CHO-K1细胞形态

细胞接种于6孔板中，培养过夜，弃去原培养液，按照分组，分别加入含有 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmol·L－1和 AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培养基，培养72 h，将细胞培养板放到倒置显微镜下观察并拍照。

1.5 TRITC-鬼笔环肽标记共聚焦显微镜检测细胞微丝[29]

将细胞接种于无菌盖玻片上(在培养皿中)，培养过夜，加入分别含 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmo·lL－1，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培养基，培养 48 h，PBS 洗 2 次，4%多聚甲醛固定，PBS洗2次，0.1%Triton X-100孵育5 min，用含有1%BSA的PBS缓冲液洗涤2次，室温下孵育60 min封闭非特异吸附，加入TRITC标记的鬼笔环肽室温染色30 min，含1%BSA的PBS缓冲液洗涤3次，共聚焦显微镜观察，与空白对照组进行比较。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞仪分析细胞凋亡率[28]

接种细胞于六孔板中，培养过夜，弃去原培养液，加入分别含有AuNP，BSO，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH的培养基，72 h后经胰酶-EDTA消化，取细胞PBS洗2次，然后使用AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒进行染色，具体步骤按照试剂盒说明书操作，染色结束后，流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC和PI阳性的比例，计算细胞凋亡的百分比，各组进行比较。

1.7 JC-1标记流式细胞仪分析细胞线粒体膜电位[29]

接种细胞于 6孔板，培养过夜，加入含有AuNP，BSO，AuNP+BSO 和 AuNP+BSO+GSH的培养基，培养48 h，收集细胞，JC-1染色，37℃20 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪分析红光和绿光强度，膜电位正常时，产生红色荧光，膜电位破坏时，产生绿色荧光，绿光强度与红光强度的比值可以反映线粒体膜电位的破坏情况。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 金纳米粒子对CHO-K1细胞存活的影响

表1 结果所示，AuNP 10，20，50 和100 μmol·L－1对卵巢细胞CHO-K1存活率无明显影响。

Tab.1 Effect of gold nanoparticles(AuNP)on CHO-K1 cell survival rate

2.2 AuNP对低GSH水平CHO-K1细胞存活的影响

表2结果所示，与正常对照组相比，单独AuNP 10 μmo·lL－1或BSO 20 μmo·lL－1对CHO-K1细胞存活无明显影响，两者联合处理细胞，能够明显抑制CHO-K1细胞存活，抑制率(82±2)%(P＜0.01)，说明细胞GSH水平被BSO抑制后，AuNP会对细胞产生毒性作用;若同时再加入外源性的 GSH 1 mmo·lL－1，细胞存活恢复至正常对照组水平。

Tab.2 Effect of AuNP on cell surival of CHO-K1 with low GSH level

2.3 AuNP对低GSH水平CHO-K1细胞形态影响

图1结果所示，与正常对照组相比(图1A)，单独AuNP 10 μmol·L－1(图1B)或 BSO 20 μmol·L－1(图1C)对CHO-K1细胞形态无明显影响，两者联合处理细胞，细胞形态发生明显改变，胞体皱缩，变圆(图1D);若同时再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，细胞形态恢复至正常对照组水平(图1E)。

2.4 AuNP对低GSH水平CHO-K1细胞微丝结构的影响

图2结果所示，与正常对照组相比(图2A)，单独AuNP 10 μmol·L－1(图2B)或 BSO 20 μmol·L－1(图2C)对CHO-K1细胞微丝结构无明显影响，两者联合处理细胞，细胞微丝结构被明显破坏(图2D);若同时再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，细胞微丝结构恢复至正常对照组水平(图2E)。

2.5 AuNP对低GSH水平CHO-K1细胞凋亡的影响

图3结果所示，与正常对照组相比(图3A)，单独AuNP 10 μmol·L－1(图3B)或 BSO 20 μmol·L－1(图3C)不能诱导CHO-K1细胞凋亡，两者联合处理细胞，细胞凋亡率明显增加，凋亡率为(65.7±5.8)%(图3D，n=3，P＜0.01);若同时再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，细胞凋亡率恢复至正常对照组水平，凋亡率为(4.3±0.7)%(图3E)。正常对照组凋亡率为(3.11±0.31)%，AuNP和BSO单独处理的细胞凋亡率分别为(3.4±0.5)%和(4.1±0.6)%，与正常对照组无显著差异。

Fig.1 Effect of AuNP on morphology of CHO-K1 cells with low GSH level.The cells were treated with drugs for 72 h.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L－1group;C:BSO 20 μmol·L－1group;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1group;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1group.

Fig.2 Effect of AuNP on microfilament of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L－1;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1;E:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1+GSH 1 mmol·L－1.The representative fields were photographed at 630×(oil)magnification by confocal laser scanning microscopy.

Fig.3 Effect of AuNP on apoptosis of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L －1;D:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1 .

2.6 AuNP对低GSH水平CHO-K1细胞线粒体膜电位的影响

表3结果所示，与正常对照组相比，单独AuNP 10 μmol·L－1或BSO 20 μmol·L－1对CHO-K1细胞线粒体膜电位无明显影响，两者联合处理细胞，细胞线粒体膜电位发生明显破坏(绿光/红光比值明显增大);若同时再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，细胞线粒体膜电位恢复至正常对照组水平。

Tab.3 Effect of AuNP on mitochondrial membrane potential of CHO-K1 cells with low GSH level

3 讨论

本研究结果显示，AuNP 浓度达到100 μmol·L－1对正常的卵巢细胞CHO-K1无明显的细胞毒性，与文献报道的良好生物兼容性一致[1，19－20]。但 AuNP的化学成分是重金属金，毒性体现不出来有两种可能，一是对细胞无毒，另外一种可能是细胞中的相应物质可以解除AuNP的毒性。文献报道GSH可能是解除AuNP毒性的关键物质[25－27]。本研究结果显示，当CHO-K1细胞GSH含量被BSO抑制后，AuNP使细胞存活率明显降低，细胞形态发生改变，微丝结构被明显破坏，细胞发生凋亡;补充外源性的GSH后，细胞存活率和细胞形态恢复，细胞无明显凋亡，与正常对照组细胞无显著差异，结果提示GSH是细胞应对AuNP毒性的重要物质。

AuNP的化学组成为金，铂类化合物可以损伤线粒体诱导细胞凋亡[31]，金与铂同为重金属化合物，有可能会对线粒体产生一定的损伤，本实验结果显示，AuNP可能通过线粒体损伤诱导低表达GSH的细胞凋亡。

本研究结果提示，AuNP的生物相容性是有条件的，即细胞需要有足够的GSH来对抗AuNP的毒性，如果因为药物和病理原因导致细胞和机体缺乏GSH，会出现AuNP的毒性。因此，要谨慎对待AuNP的生物医学特性。

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