NF-κB、MMP-9 在宫颈癌组织中的表达及意义

赵玉婵 李莲 张连梅 刘晓兰

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发生发展是涉及多基因、多阶段的复杂变化过程，核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是其中重要的一种核转录因子，参与调控多种细胞因子、粘附因子的转录过程，在炎症、免疫反应及肿瘤的发生发展中起重要作用［1］。MMP-9(matrix metalloproteinase)是细胞外基质降解的关键酶，有研究发现MMP-9 在多种恶性肿瘤中过表达，参与肿瘤的侵袭转移过程［2］。但有关宫颈癌组织NF-κB 和MMP-9 表达状况的研究甚少报道。本研究采用免疫组织化学SP 法检测宫颈癌(CSES)、子宫颈上皮内瘤样变(CIN)及正常子宫颈组织(NCE)中NF-κB 和MMP-9 蛋白的表达状况，分析其与临床病理特征的关系及意义，为阐明宫颈癌侵袭和转移的机制及判断预后提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院2010 年8 月至2011 年12 月手术切除、且经病理确诊的宫颈癌组织存档蜡块标本80 例。患者均为女性，年龄30 ～68 岁，平均年龄46.5 岁。所有患者均无肝、肾及免疫系统疾病，术前均未接受放疗、化疗和内分泌治疗，临床病理资料完整。宫颈癌病理分级及临床分期分别参照WHO(1999 年)和FIGO(1996 年)制定的标准。病理分级:高分化21 例，低分化14 例，中分化45 例;临床分期:Ⅰa 期13 例，Ⅰb期15 例，Ⅱa 期18 例，Ⅱb 期22 例，Ⅲ期以上12 例。80 例乳腺癌中有腋窝淋巴结转移者32 例，无腋窝淋巴结转移者48例。同时选取经宫颈活检证实为子宫颈上皮内瘤样变(CIN)70例(CINⅠ19 例，CINⅡ25 例，CINⅢ26 例)及正常子宫颈组织(NCE)50 例作为对照。3 组患者的年龄和体重相比差异无统计学意义(P ＞0.05)。

1.2 主要试剂兔抗人NF-κB 多克隆抗体、兔抗人MMP-9 多克隆抗体购自Santa Cruz 公司。免疫组化SP 试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 实验方法标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm厚的石蜡切片，65℃烘烤，脱蜡，采用免疫组织化学染色SP 法测定NF-κB、MMP-9 的表达，严格按照试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS 代替一抗作为阴性对照:3%H2O237℃孵育10 min 灭活内源性过氧化物酶，PBS 洗涤;微波修复抗原，PBS 洗涤;10%山羊血清封闭，室温孵育10 min;用1∶50稀释的NF-κB、MMP-9 多克隆抗体4℃过夜孵育，PBS 冲洗;加生物素标记的抗人IgG 抗体室温孵育30 min，PBS 冲洗;辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育30 min，PBS 冲洗;DAB 显色;苏木素染色，封片，光镜观察。

1.4 判定标准NF-κB、MMP-9 阳性染色判定标准为细胞质(核)内检出棕黄色颗粒。随机选取5 个有代表性的视野计数200 个细胞，若阳性细胞占同类细胞百分比＜10%为阴性。

1.5统计学分析 应用SPSS 10.0 统计软件，计数资料采用χ2检验比较各组间蛋白表达差异，相关性比较采用Spearman等级相关性分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES、CIN 及NCE 中的表达免疫组化结果显示，NF-κB 蛋白主要定位于细胞核和细胞质中，MMP-9 蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中，呈线状棕黄色颗粒。在CSES、CIN 及NCE 中，NF-κB 阳性表达率分别为72.5%(58/80)、18.6%(13/70)、0(0/50)，MMP-9 阳性表达率分别为68.8%(55/80)、15.7%(11/70)、0(0/50)，NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES 的阳性表达率显著高于CIN 和NCE，差异有统计学意义(P ＜0.05);NF-κB、MMP-9 在CIN 和NCE 中的表达无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 不同宫颈组织NF-κB、MMP-9 蛋白表达的比较例(%)

2.2 NF-κB、MMP-9 表达与宫颈癌临床病理特征的关系NFκB、MMP-9 的阳性表达与宫颈癌不同病理分级、临床分期及淋巴结转移情况密切相关，差异有统计学意义(P ＜0.05)，而与患者年龄和组织学类型无关(P ＞0.05)。见表2。

2.3 NF-κB、MMP-9 在宫颈癌中表达的相关性80 例宫颈癌组织中，NF-κB、MMP-9 表达呈明显正相关(r =0.872，P ＜0.05)。见表3。

3 讨论

NF-κB 是转录基因家族的重要成员，正常情况下与其抑制物I-κB 结合，在细胞质中呈失活状态。当细胞受到刺激后，NF-κB 与I-κB 解离并易位到细胞核中，与相应的靶序列结合，调控Bcl-2、c-myc、MMP-9 等基因的转录和表达，参与免疫和炎症反应。研究发现，NF-κB 作为一种多向性、多功能核转录因子，在乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中过表达，通过调控细胞增殖在肿瘤的发生发展、侵袭和转移中发挥重要作用［3］。

表2 NF-κB、MMP-9 表达与宫颈癌临床病理特征的关系

表3 NF-κB、MMP-9 在宫颈癌中表达的相关性比较 例

多项研究表明，宫颈癌组织和细胞系中存在NF-κB 的活性上调［4，5］。本实验中我们采用免疫组化法检测发现，NF-κB 蛋白在CSES 中的阳性表达率显著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示NF-κB 的异常表达可能是宫颈癌发生发展的重要机制之一。有关NF-κB 在宫颈癌中的作用机制尚不十分清楚，目前研究显示NF-κB 可能通过抑制细胞凋亡导致肿瘤发生，其可能机制有:(1)诱导凋亡抑制基因Bcl-2 的表达和活化;(2)诱导癌基因c-myc 的激活;(3)上调cyclinD1 的表达，促使细胞周期从G1/G0 期向S 期转化，导致细胞异常增殖。

MMP-9 是MMPs 家族的重要成员之一，参与细胞外基质和血管壁基底膜的降解和破坏。研究发现MMP-9 在几乎所有的恶性肿瘤组织中均表达增高，参与肿瘤的侵袭和转移［6］。本实验结果显示，MMP-9 蛋白在CSES 中的阳性表达率显著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示MMP-9 的异常表达参与了宫颈癌的侵袭和转移。研究发现在人类MMP-9 基因启动子区域存在NF-κB 等转录因子的结合位点，NF-κB 与其结合后可调控MMP-9 基因的转录。Yoonseo［7］采用南蛇藤素抑制NF-κB 的活性后能够显著抑制MMP-9 基因的表达，从而抑制乳腺癌细胞MCF-7 的侵袭和转移。由此可见，肿瘤的侵袭和转移过程中至少有2 个或2 个以上基因的异常表达并相互配合，从而导致肿瘤的发生发展。

本实验结果表明，NF-κB、MMP-9 的表达与患者年龄及病理类型无关，而与肿瘤组织分级、临床分期和淋巴结转移情况密切相关，提示细胞恶变程度越高，分期越晚及发生远处转移时，NF-κB、MMP-9 表达越显著。由此看出，NF-κB 的激活通过调控其下游基因MMP-9 的转录和表达，导致细胞的恶性转化和宫颈癌的侵袭转移。

1 Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B:the enemy with in.Cancer Cell，2004，6:203-208.

2 李婵玉，李力.MMP-9 及其相关因子与宫颈癌.重庆医学，2012，41:3545-3547.

3 Qiao L，Yu J，Dent P，et al.NF-kappa B protects rat ARL-6 hepatocellular carcinoma cells against hydrogen peroxide induced apoptosis.Cancer Biol Ther，2005，4:1195-1202.

4 Du CX，Wang Y.Expression of P-Akt，NF-kappaB and their correlation with human papillomavirus infection in cervical carcinoma.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33:274-277.

5 Li J，Jia H，Xie L，et al.Association of constitutive nuclear factor-kappaB activation with aggressive aspects and poor prognosis in cervical cancer.Int J Gynecol Cancer，2009，19:1421-1426.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.In vitro modulation of MMP-2 and MMP-9 in human cervical and ovarian cancer cell lines by cytokines，inducers and inhibitors.Oncol Rep，2010，23:605-614.

7 Yoonseo K.Celastrol inhibits breast cancer cell invasion via suppression of NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression.Cell Physiol Biochem，2011，28:175-184.