光学分子成像技术研究伏马毒素B1诱导植物光依赖性超敏反应的机制＊

邢富强，曾礼漳，孙爱珍，邢 达

(华南师范大学激光生命科学研究所暨教育部重点实验室，广东广州 510631)

0 引言

环境胁迫经常会影响到植物的正常生长发育过程，同时植物也会对环境影响做出相应的反应，这就是植物与环境的相互作用。植物在与病原菌的互作过程中，含无毒基因(Avr)的病菌侵染植物往往会出现超敏反应 (hypersensitive response，HR)，超敏性细胞死亡是植物抗病性的一种常见反应，植物通过这种方式可以抵御外源病原菌入侵，抑制病原菌在植物体的进一步扩散［1，2］。病原激发子 (elicitor)本身是一类来自于病原物，能够作用于植物并诱导植物产生HR的物质，作为病原菌的可致病性的毒素成分，可以应用于病原菌胁迫对植物体致病机理的研究中［3-5］。伏马毒素B1(FB1)是由串珠镰刀菌分泌的效应因子，作为病原激发子能够引起玉米等大量作物的病害减产［6］。有报道指出，FB1对人、畜也是一种潜在的致癌物，动物试验和流行病学资料已表明，FB1能够损害肝肾功能，引起马脑白质软化症和猪肺水肿等［7］，现已引起世界范围的广泛注意。目前，研究发现丁香假单胞菌，串珠镰刀菌等多种病原菌都可以引起植物出现光依赖性的HR程序性细胞死亡［8，9］，叶绿体作为植物吸收和转化光能的细胞器，推测叶绿体在HR过程中发挥着重要的作用。活性氧(ROS)爆发通常被认为是植物与病原菌的互作过程中植物对病原菌的早期反应之一［10］。目前有研究认为ROS产生的作用主要有:首先ROS具有抵抗微生物对植物入侵的作用，ROS在杀死入侵微生物的同时能够抑制病原菌的生长和继续扩散。此外，ROS在病原菌入侵或者植物受到逆境胁迫时还能够作为信号分子，通过信号级联放大诱导植物抗病相关基因的表达以及生成次生代谢产物，进而提高植物的抗病能力。但ROS是否参与FB1诱发的光依赖性的HR过程以及ROS的具体调控机制仍不清楚。

本文利用叶绿素分子的天然探针特性以及使用H2DCFDA，绿色荧光蛋白(GFP)等光学分子标记，采用光谱分析和荧光检测技术手段，通过比较固定荧光产量(Fo)，最大荧光产量(Fm)，最大光量子产量 (Fv/Fm)，实际量子产量Y(Ⅱ)，研究了伏马毒素B1侵染对拟南芥叶片光合效率的影响。同时，植物叶绿体基质定位标记GFP后，在体无损观测了叶绿体基质蛋白在FB1处理下的形态生理变化。GFP是从一种从水母体内发现的发绿色荧光的蛋白。可用于特定蛋白和各种细胞器的标记定位，如线粒体、叶绿体、细胞骨架、细胞核等等［11］。GFP标记细胞器后，可以被用来检测细胞内Ca2+、pH、电势、金属酶活力以及细胞器的形态与运动［12］。借助激光共聚焦显微镜观察，初步研究了FB1诱导的拟南芥叶片光依赖性HR早期引起细胞死亡的早期信号事件，检测了ROS信号分子的产生及亚细胞定位，细胞器形态和功能的改变，从而为今后深入开展植物光依赖性HR的机制研究提供一定的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 哥伦比亚野生型拟南芥 (ecotype Columbia，Col)种子先在4℃春化处理2-3天，然后在人工气候培养箱 (E7/2，Winnipeg，Canada)土培，光周期为 16 h/8 h(光/暗)，昼夜温度:23℃/21℃ (昼/夜)。CT-GFP转基因种子 (Maureen R.Hanson教授惠赠)。生长三周至四周的拟南芥植株用于实验。

1.1.2 主要试剂和仪器 伏马毒素B1购于上海Sigma，荧光染料 H2DCF-DA(Eugene，OR，USA)工作浓度为5μmol/L，其它普通化学试剂均为国产。激光共聚焦显微镜 (LCSM 510/confoCor2，Zeiss，Germany)，调制叶绿素荧光仪Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 FB1侵染 选取生长至四周并且状态良好的拟南芥叶片用于实验。以等量的含0.01%甲醇的水作为空白对照，10μmol/L FB1样品 (用0.01%甲醇溶解)喷洒后的植株放在人工气候培养箱中保持湿度培养。

1.2.2 原生质体的提取 方法参考张玲瑞等［13］，生长三至四周龄的拟南芥叶片，先在无光条件下适应2 d以消除光对植物的影响。用锋利的刀片将叶片切割成0.5-1.0 mm的小条。置于2.5mL酶解液(1%-1.5%的纤维素酶 R10，0.2%-0.4% 的离析酶R10，0.8 mmol/L 甘露醇，500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，100 mmol/L CaCl2)中，抽真空处理 0.5 h 后，放置在黑暗条件下酶解3 h。用孔径为35-75μm的尼龙网过滤，100 g离心力下离心3 min，弃上清，将下层原生质体小心的重新悬浮于W5(500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，500 mmol/L CaCI2，l mmol/L NaCl)溶液中，悬浮浓度为2×105个/mL。

1.2.3 叶绿素荧光成像观测与分析 采用调制荧光成像系统Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)测定不同处理下的拟南芥叶片叶绿素荧光参数。测定前，叶片先暗适应20 min，每隔 0.5 h 测定一次，得到 Fo，Fm，Fv/Fm，Y(Ⅱ)。测量光频率为 1 Hz，强度 0.5μmol/m2·s，光化光强为 165μmol/m2·s，持续 10 min;饱和脉冲强度为 2500μmol/m2·s，持续 0.8 s。

1.2.4 激光共聚焦显微观察 激光共聚焦显微镜(LSM 510 META，Carl-Zeiss，Jena，Germany)，实验用488 nm氩离子激光作为激发光源，GFP自发荧光和DCF荧光以500～550 nm的带通滤光片探测，叶绿体自发荧光650 nm的长通滤光片探测。物镜为40倍的油镜。图像及其数据使用软件Zeiss Rel 3.2系统进行分析。

2 结果与分析

2.1 伏马毒素B1对叶片光化学效率的影响

一般情况下，10μmol/L FB1处理拟南芥叶片需要4天才能出现肉眼可见的HR症状。本文使用FB1处理2天的叶片检测了光化学效率。从图1看出，光暗条件显著影响了叶绿素荧光各个参数的变化。Fo代表不参与PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量，在逆境条件下会升高。Fm是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映通过 PSⅡ的电子传递情况，Fm的下降表明植株的最大荧光效率下降。Fv/Fm是PS II潜在最大光合效率，即PS II最大量子产量，在逆境胁迫下一般会下降。Y(Ⅱ)反映了PSⅡ反应中心内的光能转换效率，该参数在正常条件下变化极小，不受物种和生长条件的影响，在逆境条件下会明显下降。在本文实验中，Fo的增加代表 PSⅡ反应中心出现可逆的失活或不易逆转的破坏，说明经FB1侵染过的拟南芥叶片，其PSⅡ反应中心受到了损伤。Y(Ⅱ)的减少表明PSⅡ反应中心内光能转换效率降低，导致光合电子传递紊乱，叶片的光合作用被显著抑制，光合效率降低。因此，实验结果表明了光参与促进FB1对叶片光合系统的损伤和光合作用的抑制过程，进而推动叶片HR的形成。

2.2 光依赖的ROS产生及其亚细胞定位

活性氧 (ROS)主要包括超氧阴离子，过氧化氢等。在病原菌与植物的互作过程中，ROS爆发通常被认为是植物对病原菌刺激的初期反应事件，从而对植物细胞造成损伤，导致细胞发生程序性死亡。因此，我们从拟南芥叶片中提取出原生质体，观察了200 nmol/L FB1处理后细胞ROS的产生情况，ROS的产生可以用荧光探针H2DCFDA监测［14］。先将荧光探针H2DCFDA于原生质体预孵育20 min，然后加FB1在光暗条件下共聚焦观察ROS的产生 (图2)。实验结果发现，在处理30 min内，FB1+Light处理组产生ROS的细胞逐渐增多，而暗处理和对照组则基本不变化或只有微小的上升，说明FB1诱导的ROS产生是光依赖性的 (图2A)。通过单细胞定位观察，DCF荧光和叶绿体自发荧光区域是重叠的，说明ROS产生主要来自于植物细胞的叶绿体 (图2B)。以上实验表明FB1诱导的拟南芥叶片原生质体ROS产生是光依赖性的，并且主要来源于细胞的叶绿体中。

2.3 ROS参与促进叶绿体降解

由图3可见，对照组在40 h时，GFP标记的叶绿体基质蛋白基本无变化，而FB1处理组中，随着处理时间的延长，GFP荧光呈现出了明显下降的趋势，说明FB1处理能明显增加了叶绿体GFP标记蛋白的降解过程。由于ROS在启动和调节细胞PCD过程中起到了重要的作用，因此我们推测其降解机制可能是由于ROS的积累作为FB1处理作为刺激的初期反应事件而引起的。因此，我们使用了ROS清除剂过氧化氢酶(CAT)和抗氧化剂抗坏血酸 (AsA)观察ROS产生对叶绿体降解的影响。CAT的主要作用是将过氧化氢分解代谢［15］，清除植物体内的 ROS，抗坏血酸则是起到抗氧化作用。结果发现，FB1+CAT和FB1+AsA处理组的GFP荧光下降速度减缓，说明CAT和AsA预处理后能明显抑制了FB1诱导的叶绿体蛋白降解过程，从而维持了叶绿体维持正常的形态和生理功能。在FB1诱导的植物HR中，ROS能诱导植物细胞发生细胞程序性死亡和叶绿体降解，并且随着诱导时间的增加会加快细胞死亡，进一步证实了ROS的产生是导致细胞程序性死亡的重要因素。

图1 A.光暗条件对FB1诱导的拟南芥叶片叶绿素荧光参数影响的照片;B.定量测定光暗条件下FB1诱导的叶绿素荧光参数的变化Fig.1 A.Chlorophyll fluorescence image of Arabidopsis leaves after infected by FB1 in the presence or absence of light.The false colour code depicted at the bottom of each image ranged from 0.000(black)to 1.000(purple);B.Quantitative analyses of changes in various chlorophyll fluorescence parameters induced by FB1 in the absence or presence of light.Each value was the mean ± S.D.of five independent leaves

图2 A.FB1诱导的拟南芥细胞光依赖性的ROS产生;(标尺=100μm);B.DCF荧光的亚细胞定位。(标尺 =20μm)Fig.2 A.FB1-induced ROS production is light-dependent in Arabidopsis cells;(Scale bars=100μm)B.The subcellular localization of DCF fluorescence.(Scale bars=20μm)

3 讨论

叶绿素荧光动力学技术在研究植物叶片的光合作用过程中对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面有在体、无损、快速的特点［16-19］。本文的叶绿素荧光成像检测结果表明在光参与FB1诱导HR过程的前期，叶绿素荧光参数Fo升高，而Fv/Fm，Y(Ⅱ)以及Fm则明显降低，说明了在光参与下FB1抑制了叶绿体的光合效能，对光合系统的损伤最为严重，所以植物光依赖性的HR过程与光合系统受损具有明显的相关性，为研究病原激发子诱导光依赖性HR的机制开拓了新的思路。

图3 FB1诱导的拟南芥叶片叶绿体产生的ROS对GFP标记的叶绿体蛋白的影响。(标尺=50μm)Fig.3 Effects of chloroplastic ROS induced by FB1on the chloroplastic GFP protein in Arabidopsis leaves.(Scale bars=50μm)

本文实验结果发现，FB1促进了光依赖性ROS的产生，并且主要来源于叶绿体(图2)，作为病原激发子FB1诱导的前期事件，这种光依赖性产生的信号分子作为启动超敏性细胞程序性死亡的前期信号可能是在叶绿体光合电子传递链受损后过剩能量引发电子泄露产生。从实验数据可以看出 (图1，2)，FB1侵染叶片后导致的ROS迸发，与光合系统受损也有明显的相关性。在植物受逆境胁迫情况下，一定剂量的ROS产生可以作为信号分子起到信号传递功能［20］。本文实验结果发现 (图3)，FB1明显促进了GFP标记的叶绿体基质蛋白的降解，而过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸(AsA)的预处理则抑制了这一过程。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，通过叶绿体带GFP蛋白的叶片实时观测FB1胁迫对叶绿体形态变化的影响，加深了我们对细胞内一些过程的了解，推动了叶绿体凋亡途径的研究。

本研究使用光学分子成像技术，为揭示病原激发子诱导的植物光依赖性的HR的机理，尤其是从分子水平阐明植物在病原激发子诱导下HR的机理提供理论基础，将有助于进一步了解植物在受周围环境胁迫下的各种生理现象的本质，对指导农业生产具有深远意义。

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