绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

崔茹鹏，沈文，鲁海富，孙延鸣

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

干扰素刺激基因 15（IFN－stimulated gene，isg15），编码蛋白为ISG15。但随后的研究发现，人的ISG15所编码的氨基酸序列实际包含165个氨基酸残基，分子质量约17.89 ku，由2个串联的与泛素同源的氨基酸序列组成，2序列间由脯氨酸残基桥接，氨基端及羧基端与泛素同源性分别为29%、31%，故又称ISG15为类泛素蛋白（ubiquitin like protein，Ubls）［1］。脊椎动物的多种细胞在受到干扰素、细菌脂多糖（LPS）、病毒感染等刺激后，ISG15可被高度诱导表达［2］。研究已证实，类泛素ISG15以及其蛋白质共价修饰对刺激细胞增殖、增强细胞抗病毒作用、促进白细胞趋化作用等先天免疫功能的过程中有着重要的作用［3－4］。细胞外的ISG15具有细胞因子的活性，参与细胞免疫的调节［5］。细胞内的ISG15在调节干扰素信号通路中起到了重要的作用［6］。目前已有一些对于ISG15功能的研究，但主要集中在人和小鼠上，其中对羊ISG15的研究更少，目前在羊上该基因是否也具有这些功能还有待进一步的研究。

本研究利用绵羊外周血淋巴细胞（PBMC）克隆获得了ISG15基因，将该基因克隆到原核表达载体p ET28a（＋）中，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）［7－10］，通过优化表达条件，得到了ISG15的高效表达产物，且该表达产物易于纯化，为进一步研究绵羊ISG15的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、DH5α和p ET－28a（＋）载体由本实验室保存；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；Taq DNA酶、T4DNA连接酶均购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶HindⅢ和Eco RⅠ、DNA分子量标准、p MD18－T、蛋白质 Marker、IPTG 购自 Fermentas公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂。

1.1.2实验动物

中国美利奴羊（新疆军垦型）5只。

1.2 方法

1.2.1引物设计与合成

根据GenBank中绵羊ISG15的基因序列（登录号：FJ844480）和 PET28a（＋）多克隆位点，利用primer 5软件设计1对特异性引物，委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

上游引物 P1为：5′－GAATTCATGGGCG－GGGACCTGA－3′，带有EcoRⅠ酶切位点和起始密码子；

下 游 引 物 P2 为：5′－AAGCTTTTTGCTACAACTTTATTCACTGCG－3′，带有 HindⅢ酶切位点和终止密码子。

1.2.2细胞总RNA的提取

从颈静脉无菌采取健康绵羊抗凝外周血，用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出PBMC，经PBS洗涤3次，用TRIzol试剂按照说明书提取总RNA：将PBMC 4℃4000 r／min离心5 min，弃上清，加入1 mL TRIzol试剂，混匀，室温静置10 min，充分裂解，加入200μL氯仿，混匀，室温静置5 min，4℃12000 r／min离心15 min；弃上清加入750 mL／L乙醇1 mL，振荡悬浮，7500 r／min离心5 min，弃上清干燥，加入无RNA酶的DEPC水中，于－70℃保存。

1.2.3 ISG15 cDNA的克隆及测序

按照RT－PCR试剂盒说明书进行操作：取上述制备的总RNA 1μg，加入20μL逆转录反应体系中，在AMV反转录酶的作用下，以Oligo（d T）为引物，于42℃50 min，95℃5 min，终止反应。将逆转录产物2μL加入到20μL的PCR反应体系，以P1、P2为引物进行扩增，反应条件为：95℃5 min，充分变性后进入循环体系：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min，取PCR产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

将RT－PCR产物回收纯化，直接与p MD18－T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌感受态中，对转化生长的菌落提取质粒，经Eco RⅠ、HindⅢ双酶切和PCR进行初步鉴定，并委托北京六合华大基因科技有限公司对其进行核苷酸序列测定，将鉴定正确的重组阳性质粒命名为p MD18－ISG15。

1.2.4原核表达载体pET28a－ISG15的构建与鉴定

将上述重组质粒p MD18－ISG15用P1、P2引物进行PCR扩增，并回收纯化，将纯化的PCR产物和表达载体p ET－28a分别用EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切，分别回收ISG15和pET－28a（＋）的目的基因片段，并用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒p ET28a－ISG15，然后转化至E.coli BL21（DE3）感受态，挑取单菌落，提取质粒，用EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切和PCR进行初步鉴定，并委托北京六合华大基因科技有限公司测序，用DNAStar软件分析插入片段的正确性，将鉴定正确的重组阳性质粒命名为p ET28a－ISG15。

1.2.5 pET28a－ISG15的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞，接种于2×LB培养液37℃培养过夜，次日按1%比例转种于同样培养液，至A600达到0.5～0.6时，加入IPTG（终浓度为1.0 mmol／L）进行诱导，诱导4 h后离心收集菌体，溶于2×SDS凝胶加样 缓 冲 液 （50 mmol／L Tris－HCl、100 mmol／L DTT、2%SDS、10%甘油）中，100℃5 min，然后进行SDS－PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，分析目的蛋白表达情况，同时设空载体和不加IPTG的对照。

1.2.6表达产物的纯化

将表达产物用Ni2＋－NTA树脂进行纯化。大量收集诱导表达的菌体，超声破碎，将上清用0.45 μm滤膜过滤，滤液装入Ni2＋－NTA树脂层析柱中，用洗脱液多次重悬树脂，取洗脱液进行SDSPAGE，分析目的蛋白的纯化效果。

2 结果

2.1 RT－PCR扩增

以绵羊PBMC细胞总RNA为模板，经RTPCR扩增，在分子量大小约541 bp位置可见清晰的扩增条带，与预期片段大小一致（图1）。

DNA测序结果与Gen－Bank中报道羊的序列相似性为98.48%（测序结果略），说明已经成功克隆了绵羊ISG15基因。

图1 ISG15基因的RT－PCR扩增结果Fig.1 The RT－PCR amplification results of the ISG15 gene

2.2 重组质粒的酶切、PCR及测序鉴定

将重组质粒p ET28a－ISG15经EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定及PCR鉴定，得到与目的基因大小一致的片段（图2、3），并且将重组质粒进行序列测定，结果表明编码ISG15的基因已经正确地插入到原核表达载体p ET－28a的克隆位点（测序结果略）。

图2 重组质粒pET28a－ISG15的PCR扩增结果Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmid pET28a－ISG15

图3 重组质粒pET28a－ISG15的双酶切鉴定结果Fig.3 The restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pET28a－ISG15

2.3 ISG15融合蛋白的表达与鉴定

将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞，用终浓度为1.0 mmol／L IPTG诱导4 h后收集菌体，经裂解后取上清进行SDS－PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果显示目的条带为25 ku，与预期结果一致，而非重组的p ET－28a（＋）中未见明显条带，说明重组质粒p ET28a－ISG15获得了表达（图4）。

图4 pET28a－ISG15在E.coli BL21中表达产物的SDS－PAGE分析Fig.4 The expression product of pET28a－ISG15 in E.coli BL21 by SDS－PAGE

2.4 表达蛋白的纯化

目的蛋白经Ni2＋－NTA树脂纯化后，得到单一的条带，纯化效果较好（图5）。

图5 pET28a－ISG15表达纯化产物的检测Fig.5 The purification of pET28a－ISG15 expressed product by SDS－PAGE analysis

3 讨论

本试验根据GenBank中的绵羊ISG15基因序列设计特异性引物，利用 RT－PCR［11－12］的方法克隆得到绵羊ISG15基因，并将绵羊ISG15基因克隆到高效表达载体p ET－28a（＋）中进行表达。本试验选用p ET－28a（＋）载体作为表达载体，主要是由于p ET－28a的MCS前面没有信号肽，直接用IPTG诱导表达，并且p ET－28a带有his标签，便于后续的蛋白纯化工作。本试验采用Ni2＋－NTA树脂对目的蛋白进行分离纯化，由于带有his标签的目的蛋白能够与Ni2＋－NTA树脂特异性结合，分离的目的蛋白纯度较高，而且Ni2＋－NTA树脂可再生反复利用，因此本试验采用Ni2＋螯合亲和层析法［13］将目的蛋白纯化。另外，为了提高目的蛋白的表达量，本试验对IPTG的不同用量及不同诱导时间分别进行了筛选与优化，找到了最佳表达条件，即当IPTG为1.0 mmol／L且诱导4 h时，ISG15融合蛋白获得了高效表达，表达的蛋白分子量为25 ku，为今后对该基因的功能研究奠定了基础。

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