苯乙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达及静息细胞生物转化乙基香兰素的研究

潘晓霞， 李静静， 何文森， 李大力， 贾承胜， 张晓鸣， 冯 骉*

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.南京理工大学 化工学院，江苏 南京210094）

乙基香兰素（Ethyl vanillin），学名3-乙氧基4-羟基苯甲醛，具有强烈的香子兰气味，香气强度为同量香兰素的3.5倍[1]，且香气更为爽快、幽雅，是重要的光谱型高档香料，其香气阙值为100[2]，广泛应用于食品、烟草、日用品中，也是重要的医药中间体。目前乙基香兰素的价格是香兰素的2倍左右，在食品、饮料、酒类等行业中，其添加量不到香兰素的三分之一，是取代香兰素的有效添加剂[3]。

到目前为止，乙基香兰素的天然来源尚无报道，市售产品均由化学法合成，主要以邻乙氧基苯酚为原料，合成过程存在收率低、污染严重等问题[4]。随着生物技术的不断发展，通过生物方法获取芳香化合物已成为近年来行业研究的热点[5-7]。用生物转化法生产香兰素的研究已经有十余年的历史，研究者采用了多种生物材料，包括真菌[8]、细菌[9-10]、基因工程菌[11]、植物细胞[12]及提取得到的酶[13]，研究了各种微生物、植物细胞内合成和降解香兰素的代谢途径。但是，对乙基香兰素的生物合成少有研究。作者提出了一条全新的生物催化合成乙基香兰素的途径，见图1。

图1 乙基香兰素生物催化途径Fig.1 Proposed route for synthesis of ethyl vanillin

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

恶臭假单胞杆菌 （Pseudomonasputida ATCC12633）；pET-28a（+）：作者所在实验室保存；重组大肠杆菌 BL21（DE3）（pET30a-mdlB）：作者所在实验室构建；受体大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）：作者所在实验室保存。

1.2 工具酶与试剂（盒）

T4DNA连接酶、dNTP、限制性内切酶 NcoI，BamHⅠ：Fermentas公司产品；Taq plus DNA聚合酶，IPTG，卡那霉素，柱式质粒小量抽提试剂盒，柱式DNA胶回收试剂盒及柱式PCR产物纯化试剂盒：上海生工生物有限公司产品；引物合成和DNA测序：上海生工生物有限公司承担；乙基香兰素标准品：Sigma公司产品；其他试剂均为分析纯国产或进口试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 mdlC基因PCR扩增 根据NCBI数据库中Pseudomonas putida中的苯乙酮酸脱羧酶基因mdlC的序列设计引物，引物序列如下：Primer1为5’-CACACCATGGTGGCTTCGGTACACGGCAC-3’， 下划 线 部 分 为 NcoI位 点 ，Primer2为 5’-CTAGGATCCTCACTTCACCGGGCTTACG-3’，下划线部分为 BamHⅠ位点，以Pseudomonas putida ATCC12633为DNA模板。反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 2 min，30个循环；72℃再延伸10 min。反应结束取样5 μL，用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以标准核酸分子为对照。PCR产物按PCR产物纯化试剂盒说明书所述方法进行回收。

1.3.2 重组质粒的构建 利用NcoI和BamH I对质粒 pET-28a（+）进行双酶切，按DNA胶回收试剂盒说明书所述方法割胶回收线性载体片段。将纯化后的PCR扩增产物与线性载体片段用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物导入大肠杆菌感受态细胞 DH5α，涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的 LB平板上。挑取单菌落至含卡那霉素（50 μg/mL）的LB液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养过夜，对重组子进行菌液PCR和Nco I/BamH I双酶切鉴定。阳性重组质粒由上海生物工程有限公司完成测序。

1.3.3 目的基因mdlC在大肠杆菌中的诱导表达重组质粒转入感受态大肠杆菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上。重组子鉴定同 1.2.2。 挑取菌落 E.coli BL21 （DE3）（pET28amdlC）接种于含卡那霉素（50 μg/mL）的 LB 液体培养液中，37℃，200 r/min振荡培养至A600nm=0.4～0.6，添加IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，将温度降至30℃后继续培养6 h，离心收集菌体，磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）洗涤1～2次后，用等体积的超纯水重悬菌体，取 100 μL 菌液，加入 20 μL 5×上样缓冲液，沸水浴加热5 min后，取10 μL进行SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析。同时，以未诱导的重组菌和含pET28a（+）空载体的重组菌为对照。

1.3.4 重组大肠杆菌发酵能力的鉴定 以乙基扁桃酸为底物，重组菌E.coli BL21（DE3）（pET30amdlB）为催化剂，将乙基扁桃酸催化脱氢，制备含有3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的转化液，并以苯乙酮酸为底物作为对照组。

根据1.2.3方法诱导18 h后，离心收集重组菌E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB），用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤细胞两次，细胞重悬于含底物5 g/L的乙 基 扁 桃 酸 的 转 化 液 （6 g/L Na2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.5 g/L NH4Cl，0.3 g/L MgSO4，pH 7.0）中，于30℃，200 r/min催化24 h后离心，除去菌体，收集含有3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的转化液。

同样的方法制备静息细胞E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC），将收集到的菌体重悬于上述含3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的转化液中，于30℃，200 r/min催化24 h，用高效液相色谱（HPLC）检测反应液中的物质的浓度。

1.3.5 重组大肠杆菌催化合成乙基香兰素 同1.2.4方法分别制备静息细胞 E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB）和 E.coli BL21 （DE3）（pET28amdlC），等质量混合，混合细胞重悬于含5 g/L乙基扁桃酸的转化液中，同样的条件催化24 h，用HPLC检测反应液中的物质的浓度。

1.3.6 分析方法 取5 mL转化液，离心除去菌体，0.22 μL针头过滤器过滤上清，用高效液相色谱仪分析，色谱条件为：色谱柱为Atlantis-C18反相柱（5 μm，3.9 mm×150 mm）， 柱温 30℃， 流量 0.6 mL/min，进样量 5 μL，流动相：V（甲醇）∶V（水）∶V（甲酸）=70∶30∶0.1，紫外检测器，波长 280 nm。

1.3.7 产物的红外分析 反应结束后，离心去除菌体，将反应液调至pH 6，用等体积的乙酸乙酯萃取1～2次，反应液中的乙基香兰素几乎全部转移至有机相，而未反应的底物乙基扁桃酸留于水相。减压蒸馏去除有机相，真空干燥得到淡黄色的乙基香兰素固体，将其复溶于45℃的水中，恒温振荡至乙基香兰素全部溶解，置于4℃冰箱，析出得到白色固体。50℃烘箱干燥去除残留水分，所得的固体经KBr压片后，进行红外分析，光谱扫描范围为4 000～600 cm-1，扫描次数为 32，分辨率为 4 cm-1，以乙基香兰素标准品作为对照。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒的构建与目的基因的表达

2.1.1 mdlC基因PCR扩增结果 以Pseudomonas putida ATCC12633为 DNA模板，经PCR扩增，扩增产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示，得到一条大小约为1 600 bp的DNA条带，与理论值（1 606 bp）相符。

图2 苯乙酮酸脱羧酶基因（mdlC）的PCR扩增产物Fig.2 PCR products of mdlC gene

2.1.2 重组表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定 以含重组质粒pET28a-mdlC的大肠杆菌DH5α为DNA模板，进行菌液PCR鉴定，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，泳道3～8都出现与mdlC基因片段（泳道1）大小一致的DNA特异性条带，且PCR结果没有杂带显示，经阴性对照（泳道2）表明，在没有模板的情况下没有特异性目的片段出现。已初步确定所挑选的菌株都插入目的基因。为了进一步确定目的片段已经连接上载体，抽提含有目的基因的重组菌质粒，对重组克隆载体进行Nco I和BamH I双酶切鉴定，以空载体pET28a（+）作为对照，结果如图4所示，泳道1为空载体pET28a（+）双酶切后得到，在约5 300 bp处出现一条带，泳道3～8出现两条带，其中一条与没有连接外源基因的空质粒双酶切得到的条带大小一致，另一条与纯化后的PCR产物（泳道2）大小一致，测序结果与GenBank中的mdlC序列一致性为100%。以上结果显示已成功构建了重组质粒pET28amdlC。

图3 菌液PCR扩增的结果Fig.3 Results of bacteria PCR

图4 重组质粒pET28a-mdlC双切酶鉴定（Nco I/BamH I）Fig.4 Results of pET28a-mdlC digested by Nco I and BamH I

2.1.3 诱导产物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE电泳结果（图5）显示：含有重组质粒pET28a-mdlC的重组菌（泳道2）经IPTG诱导在约57 000处产生一条明显的蛋白质电泳带，与文献报道的重组蛋白大小相符[14]，表明mdlC基因在宿主大肠杆菌BL21（DE3）中得到有效表达。未经诱导的重组菌（泳道1）和含空载体的菌株（泳道3、4）并没有目的蛋白的表达。所以本研究构建的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）在IPTG的诱导下能够很好地表达苯乙酮酸脱羧酶，且只有在诱导剂存在的条件下，基因mdlC才能够表达。

图5 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）全细胞蛋白电泳图Fig.5 SDS-PAGE of total proteins of E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）

2.1.4 重组菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）的发酵性能鉴定 利用重组菌 E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB）生物催化5 g/L乙基扁桃酸脱氢合成中间产物3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸，催化24 h后得到2.46 g/L 3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸，表明（S）-扁桃酸脱氢酶将所有的 （S）-乙基扁桃酸全部脱氢氧化。

重组菌 E.coli BL21 （DE3）（pET28a-mdlC）在IPTG的诱导下，成功表达了具有酶活性的苯乙酮酸脱羧酶，如图6所示，随着催化时间的延长，反应液中3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸逐渐减少，乙基香兰素逐渐增多，在催化24 h后转化液中已经检测不到3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸，得到乙基香兰素约2 g/L，即在没有优化的条件下，苯乙酮酸脱羧酶将底物全部脱羧产生乙基香兰素和CO2，高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测显示，没有任何副产物产生。对于阴性对照组 E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）），在反应过程中，底物 3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的质量浓度保持不变，且没有乙基香兰素产生。

图6 重组菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）对 3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的生物转化Fig.6 Time courses of biotransformation with E.coliBL21（DE3）（pET28a-mdlC）in the presence of 4-hydroxy-3-ethoxybenzoylformate

2.2 生物转化乙基香兰素

2.2.1 混合静息细胞生物转化 作者采用静息细胞转化法，即利用微生物整体作为反应催化剂对外源底物进行结构修饰[15]。1.2.4所述的生物转化需要两步反应如图1，利用细胞内的扁桃酸脱氢酶和苯乙酮酸脱羧酶联合作用催化底物合成乙基香兰素。作者提出了一种新的方法代替上述的两步法生物催化合成目的产物，分别将两株重组大肠杆菌培养至一定阶段后，加入诱导剂，使目的蛋白得到有效表达，当细胞内积累一定量的目的蛋白时，将两株重组菌离心分离，等质量混合，将其重新悬浮于转化液，使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态，添加底物5 g/L乙基扁桃酸，在适当的培养条件下进行转化。每隔4 h取样，用HPLC检测反应液中物质的质量浓度，发现检测不到中间产物3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸，可能是由于中间产物3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的转化速率高于乙基扁桃酸的脱氢速率，表明扁桃酸脱氢酶的催化速率是该反应速率的限制因素。底物乙基扁桃酸和产物乙基香兰素的质量浓度变化如图7所示，随着反应时间的延长，乙基香兰素逐渐增多，当反应24 h后，乙基香兰素质量浓度为1.94 g/L，与2.1.4得到的结果一致，相对应的摩尔转化率为50%。因此，利用混合细胞催化合成乙基香兰素不仅得到了与上述两步法反应一致的结果，还缩短了一半的反应时间，提高了反应效率。

图7 混合细胞生物催化反应液中的乙基扁桃酸和乙基香兰素的质量浓度变化Fig.7 Time courses of on the bioconversion of 4-hydroxy-3-ethoxymandelic acid to ethylvanillin with resting cells of two recombinant E.coli strains

2.2.2 混合静息细胞重复利用 众多研究者曾比较生长细胞与静息细胞催化法合成目的产物，发现利用静息细胞生物转化可以有效地控制转化液的组成，以适应底物转化的最佳条件[15]，同时减少了培养基成分对转化过程的影响，减少染菌的概率[16]，便于后期转化产物的分离与提纯[17]；可以提高细胞浓度，以便缩短反应时间[18]；具有利用底物能力强，转化率高、反应时间短等优点[19-20]。作者对静息细胞的重复使用次数做了试验，结果如图8所示，前3次静息细胞保持其生物活性，乙基香兰素产率尽管有轻微减少，但均维持在45%以上，可能是由于在重复操作过程中，细胞有所损失，使得细胞浓度略有减少[18]。增加重复使用次数，乙基香兰素的产率逐渐下降，当重复第6次时，乙基香兰素产率下降至25%以下。

图8 静息细胞作为生物催化剂的重复利用Fig.8 Repeated utilization of cells as biocatalyst

2.3 产物的结构鉴定

图9中A和B分别为乙基香兰素标准品和催化产物的红外光谱，可以看出，两者的峰形基本一致，主要基团的特征吸收峰为：3 356 cm-1为酚羟基的伸缩振动吸收峰；1 689 cm-1为C=O的伸缩振动吸收峰；1 575 cm-1，1 510 cm-1为苯环的 C=C骨架振动吸收峰；1 283 cm-1，1 163 cm-1为Ar-OH的CO伸缩振动吸收峰；1 258 cm-1，1 040 cm-1为苯环与OCH2中的C-O伸缩振动吸收峰；836 cm-1，784 cm-1为苯环l、2、4位取代特征吸收峰。

图9 乙基香兰素的红外光谱Fig.9 IR spectrum of ethyl vanillin

3 结语

利用基因工程技术，成功地将苯乙酮酸脱羧酶基因克隆到pET28a（+）质粒载体上，重组质粒转入到大肠杆菌BL21（DE3）中，能够有效的表达可溶性目的蛋白。利用混合静息细胞作为生物催化剂，对乙基扁桃酸脱氢氧化、脱羧合成乙基香兰素。同时试验表明，该混合静息细胞可以重复使用至少3次，有效缩短了反应时间，提高反应效率。

采用微生物静息细胞对乙基扁桃酸进行生物转化合成乙基香兰素的研究尚未见相关报道，作者在这一方面做了一些探索，提出了一种全新的合成乙基香兰素的方法。今后将在优化反应条件，提高产物的质量及作用机理方面展开进一步研究。

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