福尔可定原料药中有关物质测定方法的建立

赵学刚，冯雅慧，康海霞，滑千里，王乃浩（河北奥星集团药业有限公司，石家庄 050700）

福尔可定与磷酸可待因作用相似，具有中枢性镇咳作用，也有镇静和镇痛作用，但成瘾性较磷酸可待因弱，主要用于剧烈咳嗽和中度疼痛。新生儿和儿童易耐受此药，不致引起便秘和消化紊乱[1]。临床上已有的制剂有福尔可定片、复方福尔可定糖浆、复方福尔可定口服溶液。福尔可定已被2010年版《中国药典》（二部）、《欧洲药典》7.0版收载。《中国药典》[2]中本品采用薄层色谱（TLC）方法进行有关物质检查，采用化学比色法进行吗啡的检查，专属性较差。《欧洲药典》7.0版[3]采用高效液相色谱（HPLC）法的主成分自身对照法进行有关物质检查，但该方法不能检出工艺杂质N-（β-氯乙基）吗啉盐酸盐（CMH，因其无紫外吸收）；同时吗啡和可待因的校正因子均不在0.95～1.05范围内，因此，用主成分自身对照法测定结果不够准确。为了严格控制产品质量，笔者在此基础上，对福尔可定的有关物质检查进行了系统研究，确定采用HPLC外标法测定已知杂质吗啡、可待因，主成分自身对照法测定未知杂质和总杂质；采用气相色谱（GC）外标法测定工艺杂质CMH；同时参考2010年版《中国药典》（二部）、《欧洲药典》7.0版、ICH（人用药品注册技术规范的国际协调会）指导原则[4]制定了本品有关物质的检查限度。

1 材料

e2695型HPLC仪，配置2998二极管阵列检测器（DAD）（美国Waters公司）；6890N型GC仪（美国Agilent科技仪器有限公司）；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）。

样品：福尔可定原料药（河北奥星集团药业有限公司，批号：050901、050902、050903、061101、061102、061103，纯度：99.86%、99.85%、99.86%、99.87%、99.88%、99.87%）；福尔可定对照品（批号：171205-200504，纯度：99.8%）、吗啡对照品（批号：171201-200521，纯度：99.2%）、磷酸可待因对照品（批号：171203-200504，纯度：99.5%）均来源于中国食品药品检定研究院；CMH对照品（美国Sigma-Aldrich公司，批号：15803DH，纯度：99.9%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钾、氢氧化钠均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 HPLC检查有关物质

2.1.1 色谱条件。色谱柱：Phenomenex苯基己基柱（75 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相：乙腈-四氢呋喃-0.02 mol/L的磷酸盐缓冲溶液[量取80.0 ml氢氧化钠溶液（0.02 mol/L）和100.0 ml的磷酸二氢钾溶液（0.02 mol/L），置于1 000 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀]（75∶50∶875，V/V/V），用氢氧化钠溶液（0.2 mol/L）调整pH值至7.9±0.05，流速：1.0 ml/min；检测波长：238 nm；进样量：20 μl；柱温：35 ℃。

2.1.2 供试品溶液的制备。精密称取样品约50 mg，置于50 ml量瓶中，用混合溶剂（量取80 ml乙腈，置于1 000 ml量瓶中，用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀）溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 对照溶液的制备。精密量取“2.1.2”项供试品溶液1 ml置于100 ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.4 对照品溶液的制备。精密称取吗啡对照品、磷酸可待因对照品适量，加混合溶剂溶解并定量稀释制成每1 ml中约含吗啡10 μg、磷酸可待因26.5 μg（约相当于可待因20 μg）的溶液，作为对照品溶液。

2.1.5 专属性试验。精密称取样品约50 mg，共5份，分别进行强酸（盐酸1 mol/L）、强碱（氢氧化钠1 mol/L）、氧化（30%双氧水）、光照、高温（105℃，2 h）破坏处理后，用混合溶剂溶解并稀释制成1 mg/ml的溶液，分别精密量取续滤液20 μl注入色谱仪，同时进行DAD扫描，扫描范围为200～400 nm波长。结果表明，福尔可定与已知杂质分离较好，在各破坏条件下，主成分与降解产物能够得到良好分离，故本品中有关物质的检测方法专属性良好。

2.1.6 供试品溶液的稳定性。按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h量取20 μl，注入色谱仪，记录福尔可定峰面积。结果RSD＝0.12%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.7 回收率试验。分别精密称取样品9份，置于50 ml量瓶中，分别加入含吗啡10.12 μg/ml、磷酸可待因20.30 μg/ml的对照品溶液4、4、4、5、5、5、6、6、6 ml，溶液稀释至刻度，滤过，进样，测定其含量，计算回收率。回收率试验结果见表1。

表1 吗啡、可待因回收率试验结果（n＝9）Tab1 Results of recovery tests of morphine and codeine（n＝9）

2.1.8 线性范围的确定。分别精密量取含吗啡10 μg/ml、磷酸可待因20 μg/ml的对照品溶液2、4、5、6、7、10 ml，置于50 ml量瓶中，用混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。进样测定，分别记录吗啡、可待因的色谱峰面积。将峰面积（y）与各自的质量浓度（x）作线性回归，计算吗啡、可待因的线性方程。结果分别为吗啡：y＝17 598x－183.12（r＝0.999 4），可待因：y＝18 585x－1 020.3（r＝0.999 1）。表明吗啡和磷酸可待因检测质量浓度线性范围分别为0.404 6～2.023 2、0.812 2～4.060 8 μg/ml。

2.1.9 定量限、检测限。取“2.1.4”项下对照品溶液，逐步进行稀释，然后进样，扫峰高为基线噪声的10倍计算定量限。结果，吗啡、可待因的定量限分别为0.2、0.4 μg/ml。

配制福尔可定对照品溶液，逐步进行稀释，然后进样，扫峰高为基线噪声的3倍计算，福尔可定的检测限为2.03 ng。

2.1.10 方法精密度试验。精密量取含吗啡1 μg/ml、磷酸可待因 2 μg/ml的对照品溶液 20 μl，连续测定 6 次。结果吗啡的RSD＝1.23%，可待因的RSD＝1.46%，表明本法精密度较好。

2.1.11 有关物质的测定结果。取6批样品测定，结果见表2，其中061101批样品色谱图见图1。

表2 6批样品中有关物质测定结果Tab2 Results of content determination of related substances in 6 batches of samples

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.样品；1.吗啡；2.可待因；3.福尔可定Fig1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample；1.morphine；2.codeine；3.pholcodine

2.2GC法检查CMH

2.2.1 色谱条件。色谱柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（30 m×530 μm，3 μm），型号：J&W DB-624；柱温：160 ℃；运行时间：10 min；检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；检测器温度：280℃；检测器气源组成比例：氮气-氢气-空气（30∶30∶400）；进样口温度：250 ℃；分流比：10∶1；载气：氮气；流量：4.0 ml/min；进样量：1.0 μl。

2.2.2 供试品溶液的制备。精密称取样品适量，用甲醇溶解并定量稀释制成每1 ml中约含50 mg的溶液。

2.2.3 CMH对照品贮备液的制备。精密称取CMH约50 mg，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 CMH对照品溶液的制备。精密量取对照品贮备液5 ml，置于50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 专属性试验。取样品约0.50 g，精密称定，共5份，分别进行氧化（30%双氧水）、光照、高温（105℃，2 h）破坏处理，然后转移至10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0 μl，直接进样注入气相色谱仪。结果表明本品在氧化、光照、高温破坏条件下，CMH与降解产物能够得到良好分离。

甲醇、乙醇、苯、丁醇和甲苯是福尔可定合成工艺中用到的有机溶剂，因此还需要在本次试验色谱条件下考察5种残留溶剂对CMH测定的专属性：分别精密量取甲醇、乙醇、苯、丁醇和甲苯、CMH对照品适量，分别按“2.2.1”项下色谱条件直接进样，记录色谱图，详见图2。

图2 残留溶剂检测气相色谱图A.甲醇；B.乙醇；C.丁醇；D.甲苯；E.苯；F.CMHFig2 GC chromatograms of residual solventsA.methanol；B.ethanol；C.butanol；D.toluene；E.benzene；F.N-（βchloroethyl）morpholine hydrochloride

以上试验表明，福尔可定、吗啡、可待因以及5种残留溶剂均不会干扰CMH的测定。在氧化、高温、光照破坏条件下，CMH与降解产物能够得到良好分离，故此有关物质检测方法专属性良好。

2.2.6 供试品溶液的稳定性。按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8 h精密量取1.0 μl，直接进样，记录CMH的峰面积。结果，RSD＝2.57%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.7 线性范围的确定。分别精密量取CMH对照品贮备液1、2、4、5、7、10 ml置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录CMH的峰面积。将峰面积（y）与各自的质量浓度（x）作线性回归，并计算标准曲线方程，结果为y＝645.37x+0.137 4（r＝0.999 7），表明CMH检测质量浓度线性范围为0.010 1～0.100 9 mg/ml。

2.2.8 精密度试验。精密量取CMH对照品溶液1.0 μl，直接进样，连续测定6次。结果RSD＝1.69%，表明本方法精密度较好。

2.2.9 重复性试验。按“2.2.2”项下方法配制6份供试品溶液，分别精密量取1.0 μl，直接进样。结果RSD＝2.08%，表明本法重复性较好。

2.2.10 方法回收率试验。称取已知杂质含量的样品约0.5 g，精密称定，置于10 ml量瓶中，共9份，分别加甲醇使溶解，再分别精密加入CMH贮备液0.8、1.0、1.2 ml，各3份，再用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密量取1.0 μl，直接进样，记录色谱图。按外标法计算回收率，结果见表3。

2.2.11 CMH定量限的测定。制备CMH对照品溶液，逐步进行稀释，然后进样，扫峰高为基线噪声的10倍计算，结果其定量限为 5.0 μg/ml。

表3 CMH回收率试验结果（n＝9）Tab3 Results of recovery tests of CMH（n＝9）

2.2.12 有关物质的测定结果。取6批样品，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果CMH含量分别为0.039%、0.040%、0.036%、0.028%、0.026%、0.029%，其中061101批样品色谱见图3。

图3 有关物质CMH测定气相色谱图A.供试品；B.对照品；1.CMHFig3 GC chromatograms of related substance CMHA.test sample；B.control；1.CMH

3 讨论

（1）因没有市售的可待因对照品，笔者用磷酸可待因对照品代替可待因对照品，在计算可待因含量时应乘以换算系数0.753 4（299.36/397.36）。

（2）根据供试品实测结果及欧洲药典7.0版福尔可定原料药质量标准（吗啡≤0.2%，可待因≤0.2%，未知杂质≤0.1%，总杂质≤0.7%），同时根据2010年版《中国药典》福尔可定检查项下吗啡的杂质限度（吗啡≤0.1%）以及ICH指导原则相关内容，本着严格控制药品质量的目的，暂定本品的有关物质限度为吗啡不得过0.1%，可待因不得过0.2%，未知杂质不得过0.1%，总杂质不得过0.7%。

（3）根据供试品实测结果及ICH指导原则相关内容，福尔可定的最大日用量小于2 g，检定限度为0.10%，为了严格控制药品质量，暂定本品中的CMH限度为不得过0.10%。

[1]陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学[M].16版.北京：人民卫生出版社，2007：427.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：1 092.

[3]欧洲药品质量委员会.欧洲药典7.0[S].法国：斯特拉斯堡，2010：2 724-2 725.

[4]周海钧.药品注册的国际技术要求：质量部分[M].北京：人民卫生出版社，2007：99-110.