HPLC法测定注射用三磷酸胞苷二钠的含量和有关物质

张 彤，周长明，纪 宏，韩南银（1.北京大学药学院，北京 100091；.北京市药品检验所，北京100035）

三磷酸胞苷二钠（CTP）是核苷酸类衍生物，属于辅酶类药物，在机体内参与磷脂类及核酸的合成和代谢，是脑磷脂合成与核酸代谢的中间产物和能量来源[1-2]，对颅脑外伤后综合征及其后遗症有良好的治疗作用。注射用CTP国家标准的含量测定方法为纸电泳法[3]，该法操作烦琐、误差较大，且此标准中未对有关物质进行控制。由于CTP分子间存在高能磷酸键，注射用CTP在生产和贮存过程中很容易发生磷酸键断裂，降解成一磷酸胞苷二钠（CMP）、二磷酸胞苷二钠（CDP）等，从而对产品的质量产生影响。

笔者建立了CTP含量测定及有关物质检查的高效液相色谱（HPLC）法，结果表明该方法操作简便、灵敏度高、重复性好、专属性和耐用性较强。经方法学验证，该方法适用于CTP的质量控制。采用本方法对12个厂家的25批市售样品进行考察，结果表明不同厂家的产品质量存在较大差异。故本法也为厂家进一步从原辅料的选择、处方和工艺的优化等方面提供了较强的指导意义。

1 材料

LC-20AT型HPLC仪、SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-solution色谱工作站（日本岛津公司）；AE-240天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

CTP对照品（芜湖华仁科技有限公司，批号：11011909，纯度：98.2%，水分：3.7%；美国Sigma公司，批号：BCBC2057，纯度：95%，水分：2.1%）；CDP对照品（芜湖华仁科技有限公司，批号：11042913，纯度：98.6%，水分：2.3%）；CMP对照品（美国Sigma公司，批号：070MM1493V，纯度：99.7%，水分：23.1%）；注射用CTP市售样品（共12个厂家25批样品，规格：每支40 mg）；四丁基溴化铵及其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠17.8 g、磷酸二氢钾6.8 g，加水900 ml溶解，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入四丁基溴化铵0.80 g，加水至1000 ml，摇匀），流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃。

2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取CTP对照品适量，用流动相定量稀释制成每1 ml中约含0.4 mg的溶液，摇匀即得。

含量测定溶液：取样品加流动相溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.4 mg的溶液，摇匀即得。

有关物质检查溶液：取样品3支，加流动相将内容物溶解并全量转移至适宜的量瓶中，加流动相定量稀释制成每1 ml中约含0.4 mg的溶液，摇匀，作为供试溶液。精密量取供试溶液5 ml，置于100 ml量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.3 有关物质检测方法

2.3.1 系统适用性试验。取对照品溶液进样分析，理论板数按三磷酸胞苷计不低于3000，三磷酸胞苷与二磷酸胞苷峰及与其后相邻色谱峰之间的分离度均应＞2.0。含量测定按峰面积以外标法计算。有关物质记录色谱图至主成分保留时间的2倍，以主成分自身对照法计算有关物质的量。

2.3.2 专属性试验。取样品（安徽A厂，批号：101112）适量（约相当于CTP 20 mg）3份，分别加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml、1 mol/L盐酸1 ml、10%过氧化氢（H2O2）溶液1 ml，室温下放置1 h后中和；另取样品2份置于105℃烘箱中加热破坏2 h或在紫外灯下照射1 d。分别加水定容至50 ml，取20 μl进样分析。结果表明，本品经热破坏后，产生的杂质峰均能与主峰基线分离，说明该色谱系统能有效检测CTP的分（降）解产物；而本品对酸、碱、氧化和光稳定。色谱见图1。

图1 专属性试验高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of specificity tests

2.3.3 响应因子测定。用国产和进口CTP对照品、国产CDP对照品及进口CMP对照品初步考察了CDP和CMP与CTP质量浓度相同时在280 nm检测波长处的峰面积之比。结果表明，CTP（国产）/CDP峰面积之比为0.8004，CTP（进口）/CDP之比为0.8191，CTP（国产）/CMP之比为0.6195，CTP（进口）/CMP之比为0.6340。这与CMP/CTP分子质量比值0.622和CDP/CTP分子质量比值0.811基本一致。

2.3.4 定量限。根据测试溶液质量浓度和进样体积计算，CTP定量限（信噪比为10）为7.4 ng，CDP定量限（信噪比为10）为1.08 ng，CMP定量限（信噪比为10）为0.21 ng。

2.4 含量测定方法

2.4.1 线性关系。精密称取进口CTP对照品约0.45 g，置于200 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，再精密量取5 ml，分别置于10、25、50、100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得质量浓度分别为1860、930、372、186、93 mg/L的对照品溶液。精密量取上述5种溶液各20 μl进样分析，记录色谱图。以质量浓度（c，mg/L）对峰面积（A）进行回归，得回归方程A＝9.724×103c+2.156×105（r＝0.9997，n＝5），表明CTP检测质量浓度线性范围为90～1800 mg/L。

2.4.2 精密度试验。取质量浓度约为400 mg/L的对照品溶液，连续进样6次。结果，其峰面积的RSD＝0.28%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.3 重复性试验。取同一批样品，测定6次，结果平均含量101.0%，RSD＝1.4%（n＝6）。

2.4.4 稳定性试验。精密量取进口CTP对照品溶液，在室温下经3、5、8、19、25 h放置后分别进样。结果RSD＝0.9%（n＝5），表明供试品溶液在室温下放置25 h内稳定。

2.4.5 回收率试验。精密量取对照品溶液（约1000 mg/L）3、4、5 ml各3份，分别置于10 ml量瓶中，加处方量的辅料溶液稀释至刻度。按含量测定方法，精密量取上述溶液各20 μl进样分析，记录色谱图，计算回收率。结果，平均回收率为102.1%，RSD＝1.65%（n＝9），详见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.4.6 耐用性试验。取同一批样品，采用不同厂牌4种色谱柱测定，评价系统适用性相关指标。结果，CTP理论板数均＞3000，其中3种色谱柱CTP与CDP分离度＞2.0。

2.5 样品测定

取各市售样品，按“2.2”项下方法制备成含量测定样品溶液，同时取不含CTP的辅料同法制备成空白溶液及进口CTP对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件依法测定，记录色谱图见图2（图2为安徽A厂产品，批号：101112）；含量和有关物质测定结果见表2。

3 讨论

3.125 批样品考察结果分析

根据国家药典委员会2010－2011年度国家药品标准提高工作的相关要求，需对注射用CTP的质量标准进行补充与提高工作。目前国内该品种共有31个批准文号，最终收集到12家企业的25批样品。笔者根据原质量标准建立了含量和有关物质测定方法及考察了其方法学，并利用建立的方法对25批市售产品进行了质量考察和对比，结果发现注射用CTP主要市售产品间主成分含量和有关物质含量均存在显著性差异。

3.2 流动相的考察

图2 含量测定高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of content determination

表2 25批样品含量和有关物质测定结果Tab 2 Results of content and related substance determination of 25 batches of samples

文献[4-6]报道常用的流动相为水相或水相与有机相甲醇混合。笔者在前期试验中对多种流动相进行了比较，结果发现在水相中加入甲醇会使主峰保留时间缩短。水相多采用磷酸盐缓冲液，用氢氧化钠或三乙胺调节pH值。pH升高会延长主峰保留时间，有利于分离，普通液相色谱柱的pH使用高限为7。在流动相中加入一定量的离子对试剂四丁基溴化铵可改善分离度。磷酸盐浓度和离子对试剂浓度均对主峰保留时间有一定影响，通常较高的盐浓度能缩短主峰保留时间，而增加离子对试剂浓度可改善分离度。经过对不同流动相所记录色谱图的综合分析与比较（保留时间、峰形、理论板数、分离度），最终确定采用本法中的流动相。

3.3 检测波长的确定

本试验采用二极管阵列检测器，所以可以方便地得到供试品的紫外图谱。在试验中发现，CTP在280 nm波长处有最大吸收，CMP和CDP均在279 nm波长有最大吸收，并且空白溶液在280 nm波长处无紫外吸收，因此确定280 nm为本试验的检测波长。

3.4 定量方法的确定

CTP含量测定的方法文献报道很多。其中包括地标升国标（第16册）[3]的纸电泳法。纸电泳法操作烦琐，手动点样准确度低，且试验过程中干扰测定结果的因素较多，最终造成结果的重现性较差。另外也有采用HPLC法利用经典公式计算CTP的质量比（%），再结合紫外吸收系数法测定总核苷酸（即CTP、CMP和CDP及其他可能存在的核酸类成分的总量），最终计算得到CTP含量[7-10]。此方法不使用CTP对照品，主要是考虑CTP对照品一般纯度不高，多含CMP和CDP等有关物质，并具有较强的引湿性，且对温度敏感，需低温保存。另外在计算CTP的质量比的公式中使用的0.655和0.848分别作为CMP和CDP的折算系数，但在采用不同对照品的实际测定结果显示与此数值有差异。考虑到工艺和保存条件等的提高，对照品法是更加简易可行的方法。

本方法也同样适用于注射用CTP中有关物质的检查。在保证主成分与有关物质峰的良好分离下，同时满足为缩短试验周期对运行时间的需要，采用自身对照法定量测定有关物质。由于CDP和CMP紫外响应高于CTP，所以实际含量低于给出的结果，但不影响不同厂家间产品的质量评价。

综上所述，本试验方法操作简便、快速、专属性强、灵敏度高、重复性和耐用性好、结果准确，与原标准比较能够更好地控制产品的质量。本文的有关物质测定结果对有关生产企业加强原辅料质量控制、改进工艺并通过稳定性试验考察制订更加合理的贮藏条件和效期具有较强的指导意义。

[1]国家食品药品监督管理局.关于修订三磷酸胞苷二钠制剂说明书的通知[S].2006-02-22.

[2]郭瑞芳，李英平，李玉臣，等.三磷酸胞苷二钠对脑缺血大鼠海马CA3区突触体素表达的影响[J].中风与神经疾病杂志，2003，20（6）：529.

[3]国家食品药品监督管理局.化学药品地方标准上升国家标准：16册[S].2003：270-272.

[4]国家食品药品监督管理局.YBH21632004三磷酸胞苷二钠注射液[S].2004.

[5]国家食品药品监督管理局.YBH25922005三磷酸胞苷二钠注射液[S].2005.

[6]历文霞，苏云明，李国辉.HPLC法测定三磷酸胞苷二钠氯化钠注射液的有关物质[J].中国药师，2010，13（4）：529.

[7]国家食品药品监督管理局.YBH10172006注射用三磷酸胞苷二钠[S].2006.

[8]国家食品药品监督管理局.YBH24542006注射用三磷酸胞苷二钠[S].2006.

[9]国家食品药品监督管理局.YBH24472006注射用三磷酸胞苷二钠[S].2006.

[10]国家食品药品监督管理局.YBH04792008注射用三磷酸胞苷二钠[S].2008.