β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的体外释药特性研究Δ

袁子民，王 博，王 静，程 岚（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600）

β-榄香烯（β-Elemene，β-ELE）是一种由抗癌中药榄香烯挥发油进一步精馏纯化，主要去除γ-、δ-榄香烯异构体后得到的单体有效成分，具有一定刺激性。为降低其刺激性带来的不良反应、增加其在体内肝脏中的分布，笔者采用界面缩聚法制备了肝靶向β-ELE聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（β-ELE-PBCA-NP）[1]，为考察其释药特性，进一步预测其在体内释放情况、体内作用时间及规律；采用透析袋扩散法对其体外释药特性进行了研究，并为其制备工艺及其体内试验提供了科学依据。

1 材料

LC-10AP液相色谱仪（日本岛津公司）；药物释放溶出仪（改装，上海黄海药检仪器有限公司）。

β-ELE原料药（大连远大制药有限公司，批号：20100812，纯度：＞98%）；β-ELE对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100268-200401，纯度：＞99%）；β-ELE-PBCA-NP（自制，含量：1 mg/ml）；α-氰基丙烯酸正丁酯（BCA，北京瞬康医用胶有限公司）；泊洛沙姆（德国BASF公司，型号：188）；右旋糖酐（西安罗森伯科技有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

透析袋（截留分子质量8000～15000，上海华蓝生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 β-ELE-PBCA-NP及空白PBCA-NP的制备

取β-ELE及BCA适量，用丙酮溶解作为有机相；取泊洛沙姆及右旋糖酐适量，用蒸馏水溶解作为水相，并用0.01 mol/L盐酸调pH值至3.0。在室温、一定转速磁力搅拌下，将有机相按一定比例缓缓加入水相中，搅拌3 h至有机溶剂挥尽，用0.01 mol/L NaOH调pH为7.0，继续搅拌0.5 h，过G3漏斗，低温静置，即得乳白色泛蓝色乳光的β-ELE-PBCA-NP胶体溶液[1]。同法制得不加β-ELE的空白PBCA-NP胶体溶液。

2.2 β-ELE含量测定

2.2.1 色谱条件。色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（95∶5，V/V），流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：210 nm。

2.2.2 线性关系考察。精密称取β-ELE对照品适量，加甲醇制成每1 ml含β-ELE 0.0224 mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取β-ELE对照品1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μl，进样测定峰面积，以峰面积积分值（y）为纵坐标，β-ELE对照品进样量（x）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为y＝528008x+29.2（r＝0.9994）。结果表明，β-ELE进样量在0.0224～0.448 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.3 空白干扰试验。分别取β-ELE-PBCA-NP、空白PBCA-NP胶体溶液2 ml，分别置于处理好的透析袋内，两端扎紧，按“2.3.1”累积释放度测定方法，分别于48 h精密量取各释放介质1.0 ml，过0.45 μm微孔滤膜，滤液分别作为供试品溶液、空白对照溶液。精密吸取β-ELE对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各10 μl，进样测定。结果，空白对照溶液在与β-ELE相同保留时间处无色谱峰出现，表明其他成分对主成分含量测定无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.4 精密度试验。精密吸取同一供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，分别测定色谱峰峰面积。结果，RSD＝1.6%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.5 稳定性试验。取供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8 h后进样，测定色谱峰面积。结果，RSD＝1.5%（n＝5），表明溶液在8 h内稳定。

2.2.6 重复性试验。取β-ELE-PBCA-NP胶体溶液2 ml（约含β-ELE 2 mg左右），置于处理好的透析袋内，按“2.3.1”项下的释放度测定方法，在6 h时分别精密量取6份释放介质各1.0 ml，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液，分别测定释放介质中β-ELE的含量。结果，RSD＝1.9%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.7 回收率试验。在空白释放介质中，分别加入β-ELE对照品各3份，使其质量浓度分别为5、10、20 μg/ml，进样测定，计算回收率。结果，β-ELE低、中、高质量浓度的平均回收率分别为96.8%、97.7%、98.9%，RSD分别为1.7%、1.9%、1.8%（n＝3）。

2.3 体外释药特性研究

2.3.1 β-ELE溶液及β-ELE-PBCA-NP胶体溶液体外累积释放度的测定。分别取约含2 mg β-ELE的释放介质[即生理盐水（含50%乙醇和0.5%十二烷基硫酸钠）]及β-ELE-PBCA-NP胶体溶液2 ml（约含β-ELE 2 mg左右），分别置于处理好的透析袋内[2]，两端扎紧，固定于桨式搅拌器上，置于盛有100 ml释放介质的烧瓶内，瓶口密封，扩散池37℃恒温，转速100 r/min。分别在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48 h时精密量取释放介质1.0 ml，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液，同时补加1.0 ml释放介质。分别精密吸取2种溶液各10 μl，进样测定，计算β-ELE溶液及β-ELE-PBCA-NP胶体溶液的累积释放度，并绘制释药曲线，结果见图2。

由图2可见，β-ELE溶液8 h的累积释放度已接近90%；而β-ELE-PBCA-NP胶体溶液48 h累积释放度为70.8%，且0.5 h的累积释放度仅为8.7%。

2.3.2 体外释药模型的拟合。根据文献[3-5]，采用常用的体外释药方程对β-ELE-PBCA-NP胶体溶液的体外释药数据进行拟合。结果，β-ELE-PBCA-NP胶体溶液体外释药以Weibull方程拟合最好（r＝0.9977），详见表1（表中Q为累积释放度，t为取样时间）。

图2 2种溶液的体外释药曲线Fig 2 Release curves of 2 kinds of solution in vitro

表1 体外释药模型拟合结果Tab 1 Results of fitted release mode in vitro

2.3.3 释药机制。由图2释药曲线可知，β-ELE-PBCA-NP释药分为突释和缓释2个过程：0～4 h属于突释阶段，释放药物总量近30%，该部分药物主要来自未被包裹、黏附在纳米粒表面或包埋较浅的药物分子，使药物发生短暂的快速释放；4 h后结合在纳米粒骨架中的药物通过骨架的扩散或溶解、消化与降解慢慢释放，从而实现纳米粒对药物的缓释作用。

3 讨论

纳米粒体外释药特性的研究，常采用透析袋法、生物膜扩散等技术。本试验采用透析袋扩散技术，该法简单、易行。透析袋的预处理方法为先在纯净水中煮沸15 min，然后放入20%乙醇液中浸泡，使用时用纯净水冲洗3次。另外β-ELE量测定采用高效液相色谱（HPLC）法，前期试验中对流动相进行多次筛选，结果采用甲醇-水（95∶5，V/V）为流动相后，发现供试品色谱中待测组分分离度良好。

前期试验中对释放介质进行了筛选，采用HPLC法测定β-ELE在含20%乙醇生理盐水、40%乙醇、含50%乙醇生理盐水、含0.5%吐温80及50%乙醇生理盐水、含0.5%十二烷基硫酸钠及50%乙醇生理盐水等释放介质中形成饱和溶液时的平衡溶解度。结果，β-ELE在含0.5%十二烷基硫酸钠及50%乙醇的生理盐水中溶解度达到331 mg/L，因此选择其作为释放介质，结果表明能够到达漏槽条件。

本试验的目的主要是考察β-ELE-PBCA-NP胶体溶液是否具有突释效应及缓释作用。由释药曲线可知，与β-ELE溶液相比，β-ELE-PBCA-NP胶体溶液具有明显的缓释作用。

[1]王博，袁子民，程岚.β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备工艺研究[J].中草药，2011，42（3）：474.

[2]李艳辉，李媛，鲍美华.苦参碱聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒冻干粉针剂的制备及体外释放[J].中国医药工业杂志，2009，40（6）：425.

[3]黄义，李媛，李新中.齐墩果酸纳米囊体外释放研究[J].中药材，2008，31（2）：283.

[4]薛红，郭建鹏.月见草油微球的体外释放度研究[J].中国药房，2009，20（27）：2109.

[5]张洪，成蓓，詹新安.联苯双酯固体脂质纳米粒的体外释药特性评析[J].广东药学院学报，2009，25（1）：15.