HPLC法测定注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠的含量及有关物质

柏大为，陈 佳（泰州市食品药品检验所，江苏泰州 225300）

阿奇霉素为15元环新型大环内酯类抗菌药物[1-3]，结构上与红霉素类似[4]，作用机制也相似，是通过抑制细菌蛋白质的合成而发挥作用，且具有抗菌谱广、不良反应小等优点[5-6]。由于阿奇霉素物质自身显碱性，在一定酸性条件下不稳定[2]；而阿奇霉素枸橼酸二氢钠是阿奇霉素的枸橼酸二氢钠盐，稳定性更高，且其溶液的pH值接近人体血液酸碱度（pH 7.35～7.45），因而刺激性小、耐受性更好。国家部颁标准[7]中对其含量采用抗生素微生物检定法测定，对有关物质采用薄层色谱法测定。这2种方法操作均较复杂，试验周期长，人为影响因素较多。笔者参考有关文献[8-10]建立了高效液相色谱（HPLC）法测定注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠含量和有关物质的方法，结果表明建立的方法简便、准确、专属性强、重复性好，可用于注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠的含量及有关物质的测定。

1 材料

2695 HPLC仪、2996二极管阵列检测器（DAD）、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；AG-135电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水系统（美国密理博公司）。

样品为市售注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠（浙江普洛康裕制药有限公司，含量测定有2批，批号：20101210B、20080702，有关物质测定有5批，批号编号为1～5，规格：每支0.25 g）；阿奇霉素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130593-201002，纯度：94.3%）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：资生堂C18MG Ⅱ柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用20%的磷酸溶液调节pH至8.2）-乙腈（45∶55，V/V），流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl；检测波长：215 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备。精密称取阿奇霉素对照品53.00 mg，置于25 ml量瓶中，加流动相适量使其溶解，定容，摇匀，待用。

2.2.2 供试品溶液的制备。取样品5支，精密称定，研细；精密称取细粉适量（约相当于阿奇霉素200.00 mg），置于100 ml量瓶中，加流动相适量使其溶解，定容，摇匀，过滤，待用。

2.3 阿奇霉素含量测定方法的建立

2.3.1 线性关系考察。精密称取阿奇霉素对照品约212.06 mg，置于20 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，制成10 mg/ml的溶液。精密量取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，以阿奇霉素质量浓度（x）为横坐标，相应的峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，得线性方程为y＝9.59562x－0.16459（r＝0.9999）。结果表明，阿奇霉素检测质量浓度线性范围为0.5～3.0 mg/ml。

2.3.2 精密度试验。取“2.2.2”项下供试品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积。结果RSD＝0.7%，表明精密度良好。

2.3.3 溶液稳定性试验。取“2.2.2”项下供试品溶液，于0、1、2、4、6、8 h分别进样测定，记录色谱峰面积。结果，阿奇霉素色谱峰的RSD＝0.8%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.3.4 重复性试验。精密称取样品（批号：20101210B）6份，按“2.2.2”项下方法制备成6份供试品溶液，进样测定，记录色谱峰面积，以含量为指标计算RSD。结果样品中阿奇霉素的平均含量为99.9%，RSD＝0.8%，表明本方法的重复性良好。

2.3.5 回收率试验。精密吸取供试品溶液5 ml 9份，分别置于10 ml量瓶中，分别加入对照品溶液1、2、3 ml各3份，加流动相至刻度，摇匀，进样测定，计算回收率。结果，供试品中阿奇霉素平均回收率为100.2%，RSD＝0.7%，详见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.6 检出限。取“2.2.1”项下对照品溶液稀释70倍，进样测定，记录主成分峰高约为噪音峰高3倍时的色谱图，测得其最低检出限为4 μg/ml。

2.4 样品含量测定

取样品2批，分别按“2.2.2”项下方法每批制备3份供试品溶液，进样测定并记录峰面积；另取“2.2.1”项下对照品溶液，同法测定，记录峰面积，阿奇霉素对照品以及供试品的色谱图见图1。按外标法以峰面积计算样品中阿奇霉素的含量，并与抗生素微生物检定法相比较，结果见表2。

图1 主成分含量测定高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of main components

表2 2批样品中阿奇霉素含量测定结果Tab 2 Results of content determination of azithromycin in 2 batches of samples

2.5 有关物质的专属性试验

2.5.1 高温破坏试验。取供试品溶液在100℃条件下放置30 min，取此样液按有关物质测定法进行操作，图谱出峰时间保留至主成分出峰时间的1.5倍。结果各杂质峰与阿奇霉素之间分离度＞1.5，分离效果良好，详见图2A。

2.5.2 酸破坏试验。精密称取样品适量（约相当于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中用流动相稀释，加1 ml盐酸（1 mol/L），在沸水浴中加热25 min，冷却，用氢氧化钠（1 mol/L）调节至pH 7.0，过滤，按有关物质测定法操作。结果各杂质峰与阿奇霉素峰完全分离，详见图2B。

图2 破坏性试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of destroyed test

2.5.3 碱破坏试验。精密称取样品适量（约相当于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中，用流动相稀释，加1 ml氢氧化钠（1 mol/L），在沸水浴中加热25 min，冷却，用盐酸（1 mol/L）调节至pH 7.0，过滤，按有关物质测定法操作。结果各杂质峰与阿奇霉素峰之间分离度＞1.5，实现完全分离，详见图2C。

2.5.4 氧化破坏试验。精密称取样品适量（约相当于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中，用流动相稀释，加1 ml H2O2（30%），置于沸水浴中加热20 min，冷却，过滤，取此滤液按有关物质测定法操作。结果各杂质峰与阿奇霉素峰完全分开，有较好的分离度，详见图2D。

2.5.5 光照破坏试验。取样品适量，于4000 lx光照12 h后按有关物质测定方法操作。结果阿奇霉素峰与各杂质峰之间分离度＞1.5，完全分离，详见图2E。

2.6 样品中有关物质的测定

采用不加校正因子的自身对照法来测定，结果5批样品中有关物质的含量分别为0.9%、1.3%、1.2%、1.5%和1.1%。

综合以上结果显示，在建立的HPLC条件下，有关物质峰（降解产物峰）与主成分峰均达到基线分离，说明该色谱条件可用于阿奇霉素有关物质的检测。

3 讨论

（1）吸收波长的选择。阿奇霉素为大环内酯类抗菌药物，紫外吸收较弱，通过DAD进行全波长扫描，发现其在200 nm波长附近有末端吸收。通过比较，在215 nm波长处阿奇霉素峰出峰良好，与相邻杂质锋分离显著，杂质不干扰主药测定，故选择215 nm作为测定波长。

（2）色谱柱的选择。阿奇霉素枸橼酸二氢钠pH值偏碱性，而普通C18色谱柱中的硅醇基会造成碱性化合物的峰形拖尾，所以选用了型号为MGⅡ的ODS色谱柱。该色谱柱采用高纯度硅胶为基质，对硅胶表面进行了高分子包被，可最大限度地抑制硅醇基的影响，结果峰形满意。

（3）溶剂的选择。阿奇霉素对照品在乙腈中溶解较好，但阿奇霉素枸橼酸二氢钠在乙腈中溶解度不好，会产生浑浊。在采用流动相作溶剂后，溶解效果良好，对照品和样品均能很好溶解，故选用流动相为溶剂。

综上，通过本试验表明，所建立的HPLC法与抗生素微生物检定法含量测定结果基本一致，同时也可替代原薄层色谱法对有关物质的检测；而且所建立的方法相对更简便、快捷，并具有良好的准确性和重复性。

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