白藜芦醇对不同受体亚型MCF-7 细胞增殖的影响

王毅铮，高雅婷，胡 杰，高宏生，陈 虹

植物雌激素(phytoestrogen，PE)是指一类非甾族植物来源的具有雌激素活性的化合物，其通过与甾体雌激素受体以低亲和度结合而发挥弱的雌激素样效应［1］。体外实验证实，植物雌激素是一类生物活性较弱的雌激素［2］，具有雌激素激动剂和阻断剂效应，对于与雌激素相关的疾病有较好的防治效果［3-6］。

白藜芦醇(resveratrol，RES)又名3，5，4＇-三羟基二苯乙烯，是一种结构类似雌激素已烯雌酚(Diethy1-stilbestrol，DES)的天然多酚类化合物，其雌激素样作用目前倍受关注。Madsen［6］研究表明，植物雌激素与雌二醇(E2)竞争结合雌激素受体(ER)。E2的信号传导是由ER 介导的，而植物雌激素与ER 的作用方式是否与雌激素一致，尚无确切参考依据。本研究以白藜芦醇为对象，通过研究它对ER 及其所介导的细胞信号传导通路的影响，以讨论植物雌激素的作用机制，为防治更年期综合征等一系列激素缺乏性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 人乳腺癌细胞MCF-7(ERα+/ERβ+)由武警后勤学院免疫教研室提供。白藜芦醇(纯度＞95%)购于中国药品生物制品检定所，MTT、DMSO为美国Sigma 公司产品，RMPI1640、无酚红RMPI1640、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品，活性碳-葡聚糖处理的胎牛血清(CDTFBS)为美国Hyclone 公司产品，抗体及二抗试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 细胞培养 细胞接种于含10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素的RPMI1640 培养液中，将培养瓶置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2 d 换培养液1次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。细胞于加药前2 d 换用无酚红RPMI1640 培养液(内含5%CDT-FBS)继续培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。

1.2.2 MTT 实验 设溶剂对照组、正常MCF-7细胞组、ERα+ERβ--MCF-7(ERα+组)和ERα-ERβ+-MCF-7(ERβ+组)细胞组。取各组对数生长期细胞培养于96 孔培养板内，每孔100 μl(约含1000个细胞)，置37℃，5% CO2温箱中培养。次日，MCF-7、ERα+和ERβ+各组细胞中加入终浓度为0.1 μmol/L 的白藜芦醇(依据前期实验测得0.1 μmol/L 白藜芦醇对MCF-7 细胞有较强的增殖活性［7］)，每组至少设3个平行孔。溶剂对照组加入与给药组等体积的溶剂，继续培养。分别于加药后0～6 d 每天取一个96 孔板，弃培养液，每孔加50 μl浓度为1 mg/ml 的MTT 溶液(未加血清的无酚红RPMI1640 培养液配制)。37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μl 溶解甲簪颗粒，轻度振荡使之溶解。用酶标仪，在检测波长490 nm 条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的增殖率:增殖率(%)=(给药组平均OD值-对照组平均OD值)/(对照组平均OD值)×100%。每一实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测 取各组细胞1 ×106个，离心后去上清，PBS 洗涤一次。将细胞悬起，每管加70%冷乙醇约2 ml 固定，4°C 过夜。次日1000 r/min 离心5 min，去乙醇，PBS 洗涤2次，1000 r/min离心5 min，重复离心洗涤两次;将处理好的细胞经尼龙网过滤，PI 染色后在流式细胞仪上测定细胞凋亡率及细胞周期。

1.2.4 Western-blot 实验 各组细胞提取蛋白后，经100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离电转移至PVDF 滤膜上。滤膜经室温封闭1 h 后，加入一抗4℃孵育过夜，再与HRP 标记的二抗室温温育1 h，漂洗后BAD 试剂盒显色。结果使用Bio-rad公司Quantity One 软件进行分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0 统计软件进行统计学分析，实验数据均用±s 表示，应用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 白藜芦醇对不同ER 亚型MCF-7 细胞增殖活性的影响 0.1 μmol/L 白藜芦醇作用的各组细胞增殖活性较溶剂对照组明显增高，第5 天达峰值;与MCF-7组相比，不同亚型细胞的增殖活性表现为ERβ+＜MCF-7＜ERα+(表1)。同时应用流式细胞术检测0.1 μmol/L 白藜芦醇对各亚型细胞作用24、48 h 后各周期分布变化的情况发现，作用24 h 后ERα+细胞S 期比例较溶剂对照组和MCF-7组明显增加(P＜0.05);ERβ+细胞G0/G1期比例较溶剂对照组和MCF-7组增加，且增加程度随时间延长而显著(P＜0.05，表2)。

表1 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞作用不同时间的增殖影响 (n=3;)

表1 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞作用不同时间的增殖影响 (n=3;)

表2 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞周期分布的影响 (n=3;;%)

表2 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞周期分布的影响 (n=3;;%)

注:与溶剂对照组比较，①P＜0.05;与MCF-7 细胞组比较，②P＜0.05

2.2 白藜芦醇对不同ER 亚型MCF-7 细胞信号通路相关蛋白表达的影响 0.1 μmol/L 白藜芦醇作用48 h 后，可明显提高ERα+细胞ERK 和AKT蛋白磷酸化程度，减少p38 磷酸化蛋白的表达(P＜0.05);ERβ+细胞经白藜芦醇作用后其ERK 蛋白磷酸化明显减少，p38 蛋白磷酸化明显增加(P＜0.05，表3)，ERα+细胞组bcl-2 和caspase-3 蛋白表达较各组变化明显(P＜0.05);ERβ+细胞中caspase-3蛋白表达较各组明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05，表3)。

表3 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞相关蛋白表达的影响 (n=3;)

表3 白藜芦醇对各受体亚型MCF-7 细胞相关蛋白表达的影响 (n=3;)

注:与溶剂对照组比较，①P＜0.05;与MCF-7 细胞组比较，②P＜0.05

3 讨 论

ER 包括ERα、ERβ 两种亚型，含有6个功能区(A-F)。在体内ER 通常以异/同二聚体的形式发挥作用，两种亚型的氨基酸序列和基因序列有很高的同源性，但同时也有不同的转录激活功能［8，9］。ERα、ERβ 结构的不同决定了功能上的差异。

MTT 实验结果显示，经0.1 μmol/L 白藜芦醇作用后，各组细胞的增殖活性均高于溶剂对照组，说明白藜芦醇促细胞增殖作用明显;且ERα+细胞增殖活性高于MCF-7 细胞和ERβ+细胞，而ERβ+细胞增殖活性低于MCF-7 细胞，由此推测白藜芦醇可能通过作用于ERα 而发挥促增殖作用。由流式细胞术检测白藜芦醇对各组细胞周期分布情况的结果可见，白藜芦醇作用ERα+细胞后使其S 期比例明显增大;而与ERβ+细胞作用后G0/G1期比例明显增大，结合MTT 结果可推测，白藜芦醇促细胞增殖作用可能是与ERα 结合后增加了细胞DNA 合成;而其与ERβ 结合后，细胞周期阻滞于G0/G1期，降低了细胞的增殖活性。

以往研究认为，E2主要通过与细胞内受体结合，使受体发生变构后与相关基因结合，通过调节相关基因的表达而实现其功能，这就是传统上所谓的雌激素作用机制。雌激素还具有非基因组作用机制，该机制多与胞质内蛋白激酶系统的激活等有关。有研究发现，E2能够通过ERα 瞬时激活P38/MAPK、ERK/MAPK 和P13/AKT 通路。ERK/MAPK和P13/AKT 的磷酸化可以协同提高bcl-2 的表达水平，从而减少在P38/MAPK 激活过程中损失的Ca2+水平［10］;而在ERβ 存在的情况下，E2则只能持续激活P38/MAPK，并促进caspase-3 的激活［11］。由western-blot 结果推测，白藜芦醇可通过MAPK 和P13/AKT 通路与ER 结合来调节细胞增殖活性，同时也能通过调节下游关键因子bcl-2 和caspase-3表达而影响细胞增殖。

笔者前期实验证实，低浓度白藜芦醇有促MCF-7细胞增殖的作用［7］，由本研究结果推测可能是其与细胞内ERα 结合共同作用的结果。进而可推测低浓度白藜芦醇与ERα 亲和力较强，当与ERα结合后，可激活MAPK 和Akt，同时上调bcl-2 并下调caspase-3 蛋白表达水平，发挥其促增殖作用。白藜芦醇与ERβ 结合后对细胞作用则相反。由此可见，白藜芦醇对MCF-7 细胞的双相调节作用与ER 不同亚型亲和力有关。这也为今后开发针对激素依赖性疾病用药提供了一定的理论依据。

［1］孟庆书，何 平，朱晓燕，等.植物雌激素的作用机制［J］.生命的化学，2007，27(2):141-143.

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［7］Wang Yizheng，Cao Bo，Li Shaoxiong，et al.Effect of proliferation，cell cycle，and Bcl-2s of MCF-7 cells by resveratrol ［J］.J Asian Nat Prod Res，2009，11(4):378-388.

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