自噬溶酶体抑制剂氯化铵促进维生素K3诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用*

于春艳， 刘 希， 张 钰， 苏 静， 刘玉和△

维生素K3(vitamin K3，VK3)可以通过诱导细胞氧化应激而诱导肿瘤细胞损伤和细胞死亡［1］。我们的研究也发现维生素K3能诱导HeLa细胞发生自噬［2］。有实验发现氧化应激诱导的自噬具有维持细胞稳态的功能［3］;而另外的实验结果却显示自噬是II型程序化细胞死亡的形式［4］。可见细胞自噬的作用复杂，VK3诱导的细胞自噬在肿瘤治疗中的作用及其机制还需要进一步探讨。因此本实验以He-La细胞为研究对象，应用溶酶体抑制剂氯化铵(ammonium chloride，NH4Cl)［5］观察对 VK3 处理 HeLa 细胞的溶酶体通透性、对自噬泡形成的影响，同时观察对细胞浆pH值的影响及对VK3作用后HeLa细胞凋亡的影响，探讨VK3诱导的细胞自噬在氧化应激诱导HeLa细胞凋亡过程中的作用。

材料和方法

1 材料

人HeLa细胞购自中国科学院和北京协和医院;新生小牛血清购自 Gibco，IMDM培养基购自 Hy-Clone;MTT 粉末、吖啶橙(acridine orange，AO)、BCECF-AM和Hoechst 33342均购自Sigma;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)购自 Invitrogen。其它试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养 HeLa细胞置于完全培养基 (10%新生牛血清，IMDM 培养液，pH 7.4)中，37℃、5%CO2培养箱中培养。实验分组:对照(control)组(细胞用 IMDM 培养);VK3(30 μmol/L)组;NH4Cl(10 mmol/L)组;VK3(30 μmol/L)+NH4Cl(10 mmol/L)组。

2.2 MTT法检测细胞存活率 各组细胞以1×104cells/well接种至96孔板，每孔100 μL，每组细胞6复孔，于培养结束前4 h，加入5 g/L的MTT 20 μL。培养结束后，倾去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡混匀，使结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定其吸光度(absorbance，A)，可间接反映活细胞数量，用以检测细胞活性。对照组细胞生存率为100%，其余各组生存率(%)=(各浓度组A值/对照组A值)×100%。

2.3 AO染色检测溶酶体稳定性 将AO加入各组细胞中，终浓度为1 μmol/L，37 ℃孵育15 min，弃去染料，用PBS洗涤3次，405 nm 激发下［6］，激光共聚焦显微镜下观察并摄片。

2.4 MDC染色检测自噬泡的形成 将各组细胞爬片用含PBS的0.05 mmol/L MDC在37℃孵育60 min，孵育后的细胞用PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛室温下固定10 min，用激光共聚焦显微镜观察并摄片。以细胞内出现点状染色为阳性表现［7］。

2.5 BCECF-AM检测细胞浆pH值 取对数生长期的细胞药物处理后，胰酶消化，分别收集各组的细胞样品，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用无血清无酚红培养基洗1次。使用pH敏感的探针BCECFAM(20 μmol/L)标记细胞，37℃下孵育细胞20 min，FACScan 488 nm激发，相应的胞内pH值根据其荧光强度大小显示于二维点阵图上(X轴520 nm，Y轴640 nm)，记录520/640发射荧光，求出该比值，该比值代表碱/酸pH值的比值，此比值低，代表pH值是酸性的。R2区域代表含有酸性pH值的细胞数［8］。

2.6 Hoechst 33342染色检测凋亡细胞核形态 将10 mg/L Hoechst 33342加入各组细胞中，37℃孵育10 min，4% 多聚甲醛固定5～10 min后，弃去上清，用PBS洗涤，353～365 nm激发下显示蓝色荧光，激光共聚焦显微镜下观察，计数凋亡细胞数并计算凋亡率。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NH4Cl和VK3对HeLa细胞存活率的影响

MTT结果显示，单独应用NH4Cl对HeLa细胞存活率没有影响 ［(96.6±4.3)%］。VK3组细胞生存率为(77.1±3.3)%，VK3与氯化铵共同作用组He-La细胞存活率为(53.5±4.1)%，低于VK3作用组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2 AO染色检测溶酶体通透性

AO染色共聚焦显微镜观察显示，在VK3联合NH4Cl处理的HeLa细胞中红色荧光减弱，绿色荧光增强，而单独应用VK3或NH4Cl处理细胞AO染色没有改变，见图1。

3 MDC检测自噬泡的变化

MDC染色激光共聚显微镜观察显示，与对照组相比，在单独应用VK3作用12 h后细胞内绿色点状荧光亮度明显增强，提示VK3组细胞自吞噬泡产生明显增多。联合应用 VK3和NH4Cl与单独应用VK3相比，细胞内绿色点状荧光亮度增强更明显，提示自噬泡的数量显著增加，见图2。

Figure 1.Lysosomal permeabilization analysis for acridine orange staining in HeLa cells(×400).图1 AO染色激光共聚焦检测HeLa细胞溶酶体通透性的变化

Figure 2.Fluorescence microscopic analysis for MDC staining in HeLa cells(×400).图2 MDC染色检测HeLa细胞自噬泡的变化

4 BCECF-AM检测细胞浆酸化程度

单独应用VK3作用HeLa细胞，FL1/FL2比值降低(P ＜0.05)。联合应用 VK3和 NH4Cl，FL1/FL2比值与单独应用VK3相比明显降低(P＜0.05)，见图3。R2区域代表含有酸性pH的细胞。单独应用VK3，酸性pH的细胞比例为13.6%，联合应用VK3和NH4Cl，酸性pH的细胞比例为43.8%，提示细胞浆呈酸性，见图4。

5 Hoechst 33342检测NH4Cl和VK3对HeLa细胞凋亡的影响

经Hoechst 33342染色之后，与单独应用VK3［凋亡率(10.6±3.3)%］相比，联合应用 VK3和NH4Cl细胞核呈现固缩浓染，核分叶状或月牙状，呈典型凋亡细胞的形态，凋亡率为(28.6±3.7)%，见图5。

讨 论

Figure 3.Changes of cytosolic pH induced by NH4Cl in HeLa cellsloaded with pH-sensitive fluorescentprobe BCECF-AM.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs VK3 group.图3 BCECF-AM检测HeLa细胞胞浆酸化程度的变化

已有报道，许多抗肿瘤药物在发挥抗肿瘤作用时产生了氧化应激，而且ROS产生是药物发挥细胞毒性作用的必要因素［9］。某些化疗药物，例如三氧化二砷、evodiamine诱导 U251或 HeLa细胞产生ROS聚积，直接作用于线粒体，导致细胞凋亡［10］。研究发现，ROS 能诱导细胞自噬［4］。Zhang等［11］报道H2O2能够引起U251细胞LC3-II蛋白水平增加及自噬泡增多，用自噬早期阶段特异性抑制剂3-MA抑制自噬，降低了H2O2引起的细胞凋亡。溶酶体抑制剂氯化铵能够增加蛇毒素Crotoxin对K562细胞的细胞毒性，细胞对蛇毒素更加敏感［12］，MTT实验的结果表明，使用氯化铵后能够使VK3诱导的细胞存活率进一步降低，提示VK3诱导HeLa细胞发生的自噬可能减轻维生素K3诱导的氧化应激损伤。

Figure 4.The proportion of cells with acidic intracellular pH detected by BCECF-AM.图4 BCECF-AM检测细胞浆内酸性的细胞比例

Figure 5.Fluorescence microscopic analysis for Hoechst 33342 staining in HeLa cells treated with NH4Cl and VK3(×400).图5 Hoechst 33342检测NH4Cl和VK3对HeLa细胞凋亡的影响

自噬是溶酶体依赖的降解途径，是一个动态过程，其中最后一个过程是自噬体与溶酶体融合，最终降解细胞浆物质和细胞器［13］。Kawai等［14］用 bafilomycin A1、氯喹及氯化铵分别处理饥饿条件下的CHO细胞，发现线粒体与溶酶体没有发生共定位，结果证明溶酶体的酸性对自噬体与溶酶体融合非常必要。研究发现，自噬能清除神经退行性疾病神经元细胞中的蛋白聚集物及衰老的细胞中受损伤的线粒体等细胞器。饥饿［15］引起HeLa细胞发生自噬或者碱性药物temozolomide［16-17］引起胶质瘤细胞发生自噬时，用bafilomycin A1或羟氯喹处理后，发现自噬体与溶酶体融合被抑制，caspase激活、线粒体膜通透性增加，自噬体内容物长寿命蛋白的降解也减少。在顺铂耐受的人卵巢癌细胞及HeLa细胞中，顺铂激活的自噬能有效地运输错误折叠蛋白，使肿瘤细胞避免细胞凋亡［18-19］。有研究发现，如果不能清除细胞内堆积的蛋白质，这些蛋白将对细胞具有毒性，可能引起凋亡［20］。AO实验及MDC实验的结果表明，联合应用VK3和NH4Cl后，HeLa细胞溶酶体膜通透性增高，细胞内自噬泡大量堆积，凋亡细胞数也增多，提示NH4Cl由于增加了溶酶体通透性，阻止自噬体与溶酶体融合，促使细胞内堆积了大量自噬泡。自噬的完整过程被破坏，不能维持细胞稳态，从而促进细胞发生凋亡。

TNF-α作用U937细胞时，溶酶体组织蛋白酶D从细胞内转位至细胞浆，应用溶酶体去垢剂MSDH作用于U937细胞，也发现溶酶体组织蛋白酶D从细胞内转位至细胞浆，同时细胞浆酸化［21］。H2O2［22］或抗肿瘤药物［23］作用白血病细胞HL60，引起细胞浆酸化，进而促凋亡蛋白Bax转位至线粒体，caspase-3被激活，细胞色素C从线粒体释放入细胞浆，发生细胞凋亡。BCECF-AM实验及Hoechst 33342实验的结果表明，联合应用VK3和NH4Cl，FL1/FL2比值与单独应用VK3相比明显降低，酸性细胞数比单独应用VK3增多，细胞浆发生酸化，从而促进细胞凋亡。

总之，我们的研究证明了自噬溶酶体抑制剂氯化铵干扰细胞自噬完整过程，促使对VK3诱导的HeLa细胞凋亡增多。自噬在氧化应激诱导的凋亡中发挥了保护作用，有利于肿瘤细胞生存。联合抑制自噬作用将有利于氧化应激抗肿瘤治疗效果。

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