猪IGF－1R 基因差异表达、5'调控区的克隆及遗传多态性

李仕新，李加琪 ，田允波，陈赞谋，黄运茂，唐 军

(1.仲恺农业工程学院 生命科学学院，广东 广州5102251;2.华南农业大学 动物科学学院，广东 广州510642)

生长性状是猪的重要经济性状，一直以来为养猪生产者高度关注。动物的生长发育受神经内分泌生长轴的高度调控［1］。类胰岛素生长因子(insulin -like growth factors，IGFs)是神经内分泌生长轴的因子，是调控动物生长发育的重要因子［2-3］。IGFs 在细胞膜上有IGF -IR 和IGF -IIR 两类糖蛋白受体，其中IGF-IR 与IGF - I 的亲和力最大［4-5］，IGF - IR 主要通过与IGF - I 结合而发挥生物学作用，IGF1R 信号调控细胞增殖，分化，生长及存活［6］。

人IGF1 受体被认为是促进儿童生长的重要候选基因［7］。缺失IGF1 和IGF1 -R 的小鼠会导致减少40%和50%的出生重［8］。人IGF-1R 含有21 个外显子，长约310 kb，定位于15q25 -q26［9-10］，5'侧翼区和非翻译区GC 含量高，含有核转录因子SP1 和AP2 的结合位点［11］。

Jean-Jacques 等［12］通过辐射杂交细胞系(RH)技术把猪的IGF -1R 基因定位于5 号染色体q17 -21。Harumi 等［13］对猪的IGF -1R cDNA 进行了克隆，获得其cDNA 全长为4 236 bp，编码1 367 个氨基酸，与人和鼠的序列同源性分别为98.1%和95.2%，并用RT -PCR 方法检测到了12个序列变异。Kopecny 等［14］通过与人的IGF -1R 基因同源性比较在外显子9 和10 之间设计引物，对大白猪、汉普夏猪、梅山猪等8 个品种进行了多态性分析，发现除了杜洛克仅2 个个体没有多态性外，其他猪种均具有多态性。

为更好地从分子生物学角度研究IGF-1R 基因对猪生长发育的影响，从而为猪的选种育种提供科学依据。本文以生长速度快、瘦肉率高的长大二元杂外种猪和生长速度慢、肉质好、繁殖性能优良的广东优良地方品种大花白猪为材料，利用实时荧光定量PCR 技术检测猪IGF -1R 基因mRNA 在两猪种的不同组织的表达量;为进一步研究该基因在不同品种的组织差异表达，采用PCR 直接测序技术克隆IGF-1R 基因的5'控区及检测该区域的遗传多态性，同时通过在线预测软件预测该区域的CpG 岛分布;结果为进一步研究IGF-1R 基因的功能及猪的选种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 选用150 日龄长大二元杂猪及大花白猪各3 头的心、肝、脾、肺、肾、胃、大脑、小脑、垂体、背肌;以及用于遗传多态性研究的两猪种各20 个耳组织样。各组织样均采自广东省板岭原种猪场。切下约50 g 大小的块状组织，作好标记后样品迅速放入液氮冷冻后在-80 ℃的冰箱中备用。

1.1.2 试剂 基因组DNA 抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，TRIzol®Reagent RNA 提取试剂盒购自Invitrogen 公司，DEPC、Nasin、DNase I 购自Promega 公司，反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq荧光试剂、Ex Taq DNA 聚合酶PMD-18T 载体及DNA maker DL2000 购自TaKaRa 公司，其它试剂均为国产或进口分析纯产品。

1.2 猪基因组DNA 提取

参考上海生工生物工程有限公司的基因组DNA 提取试剂盒方法，自配试剂，抽提猪耳组织基因组DNA。抽到的DNA 加入50 μL TE，37 ℃水浴锅中水浴溶解，4 ℃保存备用。

1.3 总RNA 抽提和反转录

按照RNA 提取试剂盒使用说明提取两猪种各3 头不同部位的总RNA。经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度，稀释至1 μg/μL 备用。在经DEPC 处理过的0.2 mL 离心管中加入1 μg 总RNA，5 ×AMV Buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，RNasin 0.5 μL，AMV 反转录酶(5 U/μL)1 μL，Oligo d(T)(50 μmol/L)1 μL，加入RNase-free ddH2O 使反应终体积为20 μL，混合均匀后于42 ℃温育20 min，99 ℃5 min 以灭活反转录酶，然后降温到5 ℃保存5 min，以看家基因β -actin(AY 550069)引物扩增(表1)，验证反转录是否成功，将反转录产物置于-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 猪IGF-1R 5'调控区扩增及SNP 筛查引物 参照GenBank 中公布的人(S83519)、鼠(M37807.1)的IGF-1R 启动子序列以及猪IGF-1R(NM_214172)的mRNA 序列，设计引物P1 扩增猪IGF -1R 5'调控区片段，PCR 反应的程序:94 ℃3 min;94 ℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃1.5 min，30 个循环;72 ℃10 min。产物经电泳回收纯化后连接至pMD18 -T 克隆载体，然后转化到感受态大肠杆菌DH5α 中，经蓝白斑和氨苄筛选，重组质粒经扩大培养，提取质粒DNA 用于检测。测序工作由上海生物工程公司完成。测序后与网上的人、鼠IGF-1R 启动子序列比对，再分别设计2 对引物P2 和P3(表1)，以长大二元杂猪和大花白猪各20 头的耳组织DNA 样为模板扩增，扩增后的40 个PCR 产物等量混合后，然后通过直接测序，进行IGF-1R 5'调控区遗传多态性研究。PCR 反应条件:94 ℃3 min;94 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃30 s，30 个循环;72 ℃10 min。

1.4.2 实时荧光定量PCR 根据猪IGF-1R 基因的mRNA 序列(NM_214172)设计定量引物P4 以及以β-actin 基因(AY 550069)作为内参基因(表1)。实时荧光定量PCR 反应条件:采用25 μL 体系，各反应成分为:12.5 μLSYBR 预混液，10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，灭菌超纯水10.5 μL。混匀，离心，放入PCR 仪扩增。PCR 反应条件为:94 ℃30 s;95 ℃5 s，62 ℃30 s，40 个循环。反应中以灭菌双蒸水为阴性对照。每个样本取样3 次。使用仪器为Bio-Rad 公司的iQ5。反应结束后收集Ct 值，采用△Ct 法来度量。具体做法是将每个样品的Ct 平均值减去对应样品的β -actin 平均Ct 值得到各个组织的△Ct 值，即△Ct =样品目的基因Ct 均值-样品β -actin Ct 均值，最后用公式2-△△Ct计算［15］。数值以平均值 ±标准误(Mean±SE)表示［16］。

所有PCR 引物设计均使用Primer Premier 5.0 软件设计，由上海生物工程公司合成，引物序列信息如表1。

1.5 CpG 岛预测

将获得的IGF-1R 5'调控区序列利用在线软件http://www.urogene.org/methprimer/index1.html 分析预测其潜在的CpG 岛的分布。

表1 PCR 引物序列信息Tab.1 Information of primer sequences in PCR

2 结果与分析

2.1 RNA 抽提的结果

用15 g/L 普通琼脂糖凝胶电泳检测长大二元杂猪和大花白猪的各组织总RNA，结果如图1 所示:这些组织中的28S 的亮度都很好，可以用于后续试验。

2.2 基因差异表达

使用引物P4，以 β -actin 为内参，以猪肝组织中的mRNA 含量作为基准含量，分别对长大二元杂猪和大花白猪的10 个组织mRNA 含量进行分析(图2)。由图2 可知IGF-1R 的mRNA 表达量在两猪种的不同组织中都表现这样一个规律，也就是在心脏的表达量最高，在肝脏的mRNA 表达量差异不显著。但在长大二元杂外种猪的心、肾、背肌、大脑、小脑、垂体中表达量明显高于大花白猪，分别是6.06 倍、52.56 倍、7.70 倍、2.43 倍、3.63 倍和41.38 倍，在心脏的表达量为最高，在肾脏也有较高的表达，而在胃、脾、肺的表达量明显低于大花白猪。

图1 总RNA 的15 g/L 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Result of 15 g/L agrose gel electrophoresis for total RNA

图中数据以肝脏的表达量作为基准含量。Data are normalized to liver.图2 猪IGF-1R mRNA 在两猪种不同组织中的表达Fig.2 Relative level of the IGF-1R mRNA in different tissues in the two breeds.

图3 猪IGF-1R 基因5'调控区扩增结果Fig.3 The result of PCR amplification of the porcine IGF-1R 5'regulatory region

2.3 猪IGF－1R 5'调控区的获取

以长白猪基因组DNA 为模板，以表1 中引物P1 进行PCR 扩增，扩增产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到了特异性的扩增片段(图1)，将这些片段回收、纯化及克隆测序，之后与网上序列进行同源比对。证明获得1 355 bp 的IGF-1R 5'调控区序列。经过与人、鼠IGF-1R 5'序列比对，发现同源性分别达到84%及81%。猪IGF-1R 5'调控区序列的完整获取为下一步进行功能分析奠定良好的基础。

2.4 猪IGF－1R 5'调控区的遗传多态性

2.4.1 猪IGF-1R 5'调控区2 个片段扩增结果 分别使用引物P2、P3，以长大二元杂猪及大花白猪的耳组织DNA 为模板，将5'调控区分2 个区段扩增，都得到条带清晰的特异性条带(图4 A 和B)。

图4 PCR 扩增部分结果Fig.4 The part results of PCR amplification

2.4.2 引物P2、P3 产物部分测序结果 使用引物P2、P3，分别以两品种猪的DNA 样各20 份为模板进行PCR 扩增，所得的80 份PCR 产物送公司进行双向测序。从测序结果看，没有发现出现单核苷酸多态的双峰以及序列的插入、缺失和重复。证明这2 个片段不存遗传多态性。

2.5 猪IGF－1R 5'调控区CpG 岛预测

将获得的5'调控区序列通过网上在线检测，发现存在3 个CpG 岛，分别长352 bp、602 bp 和263 bp，详见图5。

图5 猪IGF-1R 5'调控区CpG 岛预测Fig.5 Prediction of CpG islang within porcine IGF-1R 5'regulatory region

3 讨论

3.1 猪IGF－1R 的差异表达分析

不同猪种的组织差异表达分析是研究基因功能的重要基础性工作，对IGF -1R 基因表达调控的研究主要集中在人和小鼠，目前对猪IGF-1R 的研究还不够深入的。在研究人IGF -1R mRNA 的表达调控时发现BRCA1、WT1、p53 等抑癌基因能抑制IGF -1R 的转录［17］。IGF -1R 调控着细胞增殖、凋亡、运动及分化等过程，在小鼠的胚泡形成阶段使用特异性抗体消除IGF -1R 的信号途径能阻止滋养外胚层形成而使胚胎无法存活［6］。在研究牛IGF-1R 的表达时发现，妊娠期母牛的蛋白质摄入会影响牛犊骨骼肌的IGF-1R 的表达［18］。在猪的研究方面，有研究表明IGF-1R 的mRNA 表达量在90 日龄的蓝塘猪及27 日龄的长白猪的肝脏中表达量为最高［19-20］，在初生仔猪的肌肉表达量最高，随着日龄增长，表达量呈逐渐下降的趋势［19-20］。徐金先等［21］研究发现，大白猪和二花脸猪IGF -1R 的mRNA 表达在垂体存在年龄、品种间差异。Mariusz Pierzchała 等［22］研究后备母猪的不同发育阶段的GHR，IGF1R，IGF1 及IGF2 基因在肝脏组织的表达量时发现，IGF -1R 在波兰长白猪150、180 和210 日龄的表达量最高，进一步的性状关联分析发现IGF-1R 在肝脏的表达量与胴体组成性状存在显著相关，提示IGF -1R 可能是胴体组成性状的重要候选基因。蔡兆伟［23］在研究阉割影响猪脂肪沉积的分子机理时发现与非阉割相比，IGF-1R 基因mRNA 表达量在阉割猪肝脏及皮下脂肪组织中均显著下调。以上的这些研究都集中于肌肉、脑、及肝脏组织，而对该基因在心脏、肺、肾等器官的表达未见报道。本研究表明，IGF-1R 在长大二元杂和大花白猪的组织中的表达量都表现在心脏的表达量最高，在肝脏的表达量差异不显著这样的规律。在长大二元杂猪的心、肺、背肌、大脑、小脑、垂体中IGF-1R 的mRNA 表达量显著高于大花白猪，而在胃、脾、肺的表达量明显低于大花白猪。尤为值得关注的是在心脏的表达量为最高，在肾脏也有较高的表达，提示IGF-1R 在长大二元杂猪的心脏和肾脏中起着非常重要作用，这也可能与这2 种不同类型猪的生长发育规律有关，也说明该基因表达存在明显的品种及组织差异，提示IGF -1R可能是猪生长性状的重要候选基因。

3.2 猪IGF－1R 5'调控区的获取

参照GenBank 中公布的人(S83519)、鼠(M37807.1)的IGF-1R 启动子序列以及猪IG -F1R(NM_214172)的mRNA 序列，设计引物扩增猪IGF-1R 5'调控区片段，经过测序与比对，获得猪IGF -1R 5'调控区1 356 bp 的序列，经过与人、鼠启动子序列比对，发现同源性分别达到84%及81%，提示该基因的5'调控区所具有的功能可能极为相似，5'调控区序列的获得为进一步研究该基因的5'调控区功能打下良好基础。

3.3 猪IGF－1R 5'调控区的遗传多态分析

基因的表达调控是一个重要的、高度协调、复杂的过程。转录水平的调控其实是启动子的调控起主导作用。鉴定可靠的顺式作用启动子的遗传变异影响基因表达调控仍然是基因组学的一个挑战。本实验在获得了IGF-1R 基因5'调控区后，设计了2 对引物，用PCR -直接测序方法对该区域进行SNP 筛查，并仔细判读了测序峰图。在PCR 产物直接测序时，我们利用2 个不同品种猪个20 份DNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 产物进行双向测序。为得到真正的SNP 信息，将序列的长度都选择在300 bp 左右的合适范围内。在测序的峰图中我们没有发现含有一些明显的多态信息，所有测序后序列进行比对，序列都表现出一致性。测序结果尚未发现5'调控区的遗传多态性的存在。

3.4 猪IGF－1R 5'调控区CpG 岛预测

以此同时，笔者对猪IGF -1R 5'调控区进行了CpG 岛的预测。发现存在3 个CpG 岛，分别长352 bp，602 bp 和263 bp，提示猪IGF -1R 的表达调控较为复杂。基因组中大约有60% ～90%的CpG是甲基化的［24］，DNA 甲基化是真核生物表观遗传学重要的机制之一，对基因转录水平的表达具有重要的调控作用。启动子区域高甲基化状态的CpG 岛会导致基因沉默;低甲基化状态的CpG 岛有利于基因的表达［21］。存在的3 个CpG 岛对基因的表达调控可能非常重要，也表明该基因的表达也极为复杂。本研究试图在表观遗传学研究方面做有益的尝试。

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