UPLC-ELSD法测定芪白平肺胶囊中黄芪甲苷

孟 楣，魏良兵，王 芳，李茜茜，李泽庚*

(1.安徽中医学院第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥 230031;2.安徽中医学院，安徽合肥 230031;3.亳州市华佗中医院，安徽亳州 236800)

芪白平肺胶囊是安徽中医学院第一附属医院的 医院制剂(专利号ZL 201010573274.1)，该制剂由黄芪、生晒参、川芎等七味中药组成，具有益气温阳、化痰散瘀之功效，适用于慢性阻塞性肺疾病急性发作期和缓解期［1-2］。方中君药是黄芪，苷类成分是其主要活性组分，也是芪白平肺胶囊发挥药效的物质基础，其中黄芪甲苷具有改善心肺功能、加强心脏收缩力、调动机体免疫功能等作用［3］，故黄芪甲苷的提取率与该制剂的主要疗效有关。

半 仿 生 提 取 法［4-7］(Semi-bionicExtraction method，SBE法)是从现代生物药剂学的角度、模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境、采用活性指导下导向分离的一种方法。本实验采用此提取模式，与传统的水提法(WE法)进行比较，同时以黄芪甲苷的量为评价指标，以此选择该药更好的提取方式，为以后芪白平肺胶囊的新药研究奠定一定的基础。有关黄芪甲苷的定量测定方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射法［8-9］、HPLC-UV 法［10］、HPLC示差折光检测器法［11］，本实验采用的是超高效液相色谱-蒸发光散射法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括:四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、Acquity ELSD检测器以及Waters Empower2软件;Acquity UPLC BEH C18色 谱 柱(2.1mm×50mm，1.7μm);KQ3200DB型数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司);Sartorius PH酸度计(德国塞多利斯公司);Sartorius BP211D十万分之一天平(德国塞多利斯公司);HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂);BCD-277西门子电冰箱;SK3200H超声仪。

1.2 试药 黄芪甲苷(中国食品药品检定研究院，批号1100781-200613);黄芪、川芎、地龙、五味子、葶苈子、薤白(安徽中医学院第一附属医院中药房提供，由安徽中医学院第一附属医院李立华主任药师鉴定);甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司);水为纯化水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 应用半仿生提取法与水提法提取芪白平肺胶囊

2.1.1 应用半仿生提取法提取芪白平肺胶囊［12］按芪白平肺胶囊的制剂提取工艺，将该组方3份，水煎煮提取3次，依次加10、10、8倍量的水煎煮1.5、1.0、1.0 h，pH 值依次为 pH 2.00，pH 7.50，pH 9.00，合并煎液，过滤，滤液浓缩至250 mL，得样品SBE液，标记为半仿生液1、2、3号。

2.1.2 应用水提法提取芪白平肺胶囊 按芪白平肺胶囊的制剂提取工艺，将该组方3份水煎煮提取3次，依次加10、10、8倍量的水煎煮1.5、1.0、1.0 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至250 mL，得样品水提液，标记为水提液1、2、3号。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.540 mg对照品溶液，作为黄芪甲苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

2.2.2.1 半仿生提取法液供试品溶液制备 精密吸取半仿生提取法液1、2、3号各10 mL，置圆底烧瓶中，蒸干，加甲醇50 mL，精密称定，回流提取1 h，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水30 mL，微热溶解，饱和正丁醇40 mL萃取4次，合并正丁醇液，氨试液充分洗涤4次，每次40 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，放冷，过D101型大孔吸附型树脂柱(内径1.5 cm，长12 cm)，依次以水50 mL、40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，即得半仿生供试品溶液，标记为半仿生供试品溶液1、2、3号。

2.2.2.2 水提液供试品溶液制备 精密吸取水提液1、2、3号各10 mL，置圆底烧瓶瓶中，蒸干，加甲醇50 mL，其余操作同2.2.2.1项处理方法，得水提液供试品溶液，标记为水提供试品溶液1、2、3号。

2.3 色谱条件［13-15］Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×500 mm，1.7μm);流动相乙腈-水(33∶67);体积流量0.3 mL/min;柱温30℃;喷雾器温度30℃;漂移管温度为80℃。

2.4 系统适应性试验 分别吸取对照品溶液3μL，半仿生提取法供试品溶液、水提供试品溶液各5μL，按2.3项下色谱条件，用UPLC-ELSD测定，结果半仿生提取法供试品溶液和水提液供试品溶液中黄芪甲苷的保留时间与对照品溶液的保留时间一致，与其他物质峰分离度大于1.5，理论塔板数均在4000上，黄芪甲苷色谱峰的蒸发光光谱与对照品的蒸发光光谱一致。结果见图1。

图1 黄芪甲苷对照品(A)、半仿生液供试品(B)、水提液供试品(C)的 UPLCELSD色谱图Fig.1 UPLC-ELSD chromatograms of astragaloside reference substances(A)，sample of SBE(B)，sample of WE(C)

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系的考察 取黄芪甲苷对照品溶液(0.540 mg/mL)，进样量依次为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μL 记为 B1、B2、B3、B4、B5、B6的系列进样量的对照品溶液。按2.3项下色谱条件进行测定，以进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为 Y=7953168.571X-8446347.676，r=0.9999(n=6)，结果表明:黄芪甲苷进样量在1.08～2.43μg的范围内有良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(0.540 mg/mL)3μL。按2.3项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，黄芪甲苷对照品峰面积积分值的RSD值为0.13%(n=6)。结果表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取半仿生供试品溶液1号，按2.3项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样5μL，测定并记录黄芪甲苷的峰面积积分值，计算RSD为1.61%(n=6)。结果表明黄芪甲苷在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 精密吸取半仿生样品溶液1号，每份10 mL共6份，编号为1～6，按2.2.2.1项下方法制成供试品溶液，分别按2.3项下色谱条件，分别进样5μL测定，计算黄芪甲苷峰面积积分值 RSD为1.12%(n=6)，结果表明重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密吸取半仿生样品溶液1号，每份10 mL共6份，精密加入黄芪甲苷溶液(1.4250 mg/mL)2 mL，按2.2.2.1项下方法制成供试品溶液，按2.3项下色谱条件，计算回收率。结果:平均回收率为99.05%，RSD为0.58%(n=6)，表明回收率良好。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for astragaloside

表2 半仿生提取法液中黄芪甲苷测定结果Tab.2 Determination results of astragaloside in the samples of SBE

表3 水提液中黄芪甲苷测定结果Tab.3 Determination results of astragaloside in the samples of WE

2.6 实验结果 同批药材，同种测定方法，半仿生提取法液中黄芪甲苷的平均质量浓度为0.2848 mg/mL，水提液中黄芪甲苷的平均质量浓度为0.2360 mg/mL，可以得出用半仿生提取法提取芪白平肺胶囊其黄芪甲苷的提取效率高于水提法提取。

3 讨论

3.1 参照2010年版《中国药典》一部黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的色谱条件［16］，对流动相乙腈-水的比例进行了筛选，考察了出峰时间和色谱分离情况，结果以乙腈-水(33∶67)为流动相时，黄芪甲苷色谱峰出峰时间合适，分离效果最佳。

3.2 将单纯的水提法替代为半仿生提取法，更加接近人体的消化环境，且符合中医的实际应用;查阅半仿生提取法的研究资料、结合制剂的生产实际、并根据前期实验结果，确定了该制剂的半仿生提取法提取条件。

3.3 黄芪甲苷为芪白平肺胶囊中主要成分之一，据报道黄芪甲苷提取物中部分以衍生物黄芪总皂苷的形式存在，碱性条件可以使衍生物水解黄芪甲苷，本实验对正丁醇萃取液经氨试液洗涤的洗涤时间进行考察(0.5、1、1.5 h)，结果表明氨试液洗涤时间的延长，黄芪甲苷的含量增加，且图谱中杂质少，干扰小，为质量控制提供依据。

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