籽瓜多糖的提取分离及单糖组成的GC-MS 分析*

宋珅，赵保堂，殷振雄，刘琴，梁俊玉，2，张继，2

1(西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州，730070)

2(甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃 兰州，730070)

籽瓜又名打瓜，形状与西瓜类似，但比西瓜略小，多籽，味淡。根据《本草纲目》记载“籽瓜性味甘”。“籽瓜入心脾胃，肉有降心脾胃热，止消渴”，该功效已被众多消费者所认同。主要产地在吉林、内蒙古、甘肃、山西、新疆等省，在甘肃其产量很大，其籽是加工炒食的主要原料，而目前取籽后剩余占籽瓜总质量93%的瓤皮一般都被丢弃，不仅造成环境污染，而且浪费大量的资源。籽瓜的瓜和瓜皮，每百克含糖8%左右，含VA、VB、VC、VPP及钙、磷、铁等，有散热、解渴、利尿等功效［1］。王翠平对籽瓜皮和瓢作了研究，表明籽瓜皮和籽瓜瓤具有一定的的清除DPPH·、OH·、ABTS·自由基能力和抑制肝癌细胞7721 生长的活性，可作为一种良好的天然抗氧化剂及抗肿瘤活性物质［2］。多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，同时又能促进干扰素生成，促进白细胞介素生成，诱生肿瘤坏死因子等重要的生理功能［3］。从籽瓜瓜瓤中提取籽瓜多糖是对籽瓜皮瓤“废物利用”，既解决了籽瓜去籽后产生污染问题，又提高了籽瓜经济效益，是籽瓜综合利用的有效途径之一。本文采用微波波辅助提取法研究了各种因素对籽瓜多糖产率的影响，确定了适宜的提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜籽瓜(甘肃白银市靖远县);无水乙醇、三氯甲烷、三氟乙酸、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐、溴化钾均为分析纯。

1.2 实验仪器

J0500-3 型电子天平，沈阳龙腾电子有限公司;NJC03-2 型微波提取设备，南京汇研微波系统工程有限公司;TDL5M 型台式大容量冷冻离心机，湘仪离心机厂;LGJ-185 型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司;RE-52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;UV9100B 型紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司;IS10 型傅立叶红外光谱仪，美国Thermo 公司;气相色谱质谱联用仪，美国Thermo 公司。

1.3 微波辅助提取籽瓜多糖

原材料预处理:籽瓜切碎去除瓜子和瓜皮后粉碎得到籽瓜汁待用。

取一定量预处理后的籽瓜汁，以蒸馏水为溶剂，采用不同料液比、微波功率、提取温度、提取时间在微波提取装置中进行籽瓜多糖的微波辅助提取试验。提取液经过离心后减压浓缩至较小体积，加入无水乙醇至终浓度为85%，醇沉24h 后离心，下层沉淀经冷冻干燥得到籽瓜粗多糖。籽瓜粗多糖经酶和Sevage偶联法脱蛋白后浓缩、醇沉冷冻干燥后得到籽瓜精糖备用。

多糖得率和总糖含量的计算方法:

苯酚硫酸法测定总糖含量［4］。

1.3.1 单因素实验

影响微波辅助提取多糖得率的主要因素有液料比、微波功率、提取温度、取时间和提取次数等。本实验在料液比为(g∶mL)1∶1，提取温度为60℃，功率为300 W 的前提下，提取时间分别选取5、10、20、30、60 min 这5 个水平;在料液比为1 ∶1，提取时间为30 min，功率为300 W 的前提下，提取温度分别选取30、40、50、60、70 和80℃6 个水平;在料液比为1∶1，提取时间为30 min，温度为60℃为的前提下，微波功率分别选取100、200、300、400、500 W 这5 个水平;在功率为300 W，提取时间为30 min，温度为60℃为的前提下，料液比分别选取3∶2、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(g∶mL)5 个水平进行实验，每组平行3 次，计算籽瓜多糖的得率。

1.3.2 响应面分析法实验设计

选择单因素试验中对响应值(籽瓜多糖得率)有显著影响的因素。采用SAS(SAS Package，Version 8. 2)对实验数据进行回归分析。每一自变量的低、中、高实验水平分别以－1，0，1 进行编码，该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为:

其中Y为响应值(籽瓜多糖得率)，A0，Ai，Aii，Aij为方程系数，Xi为自变量编码值一次项，Xii为自变量编码值二次项，Xij(i≠j)为自变量编码值交互项，建立实验数学模型，以提取时间(X1)、提取温度(X2)、料液比(X3)和微波功率(X4)值为自变量，以－1、0、1 分别代表自变量水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码。其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长(表1)，4 个变量共计29 种组合。

实验因素、水平及编码如表1 所示:

表1 实验因素、水平及编码Table 1 Experiment factors，levels and code

1.4 籽瓜多糖的红外光谱分析

充分干燥的籽瓜多糖样品用KBr 压片，4000 －400 cm－1波长范围内扫描，扫描次数16 次，分辨率为4 cm－1。

1.5 籽瓜多糖的GC-MS 分析

糖腈乙酸酯衍生物的制备:10 mg SWP，加4 mL 4 mol/L 的CF3COOH，充N2，120℃密闭水解4h。减压蒸干，加入10 mg 盐酸羟胺，0.5 mL 吡啶，于90℃油浴中反应30 min。加入0.5 mL 乙酸酐，在90℃油浴乙酰化30 min，反应产物减压蒸干。

衍生物的GC-MS 分析:用1 mL 的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22 μm 有机滤膜过滤。然后吸取0.2 ul 进样，GC-MS 分析。分析条件:以160℃开始，保留3 min，以2 ℃/min 线性升到210℃。载气为氦气，柱流量1.0 mL/min，进样口温度:250℃;质谱条件:EI源;电离电压:70eV;离子源温度:250℃;扫描范围:33 ～550aum;分流比:50∶1。

对照标准单糖:葡萄糖(Glu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、来苏糖(Lyx)做同样处理。

2 实验结果与分析

2.1 单因素实验中各因素对提取率的影响

2.1.1 微波提取时间对多糖得率的影响

由图1 可知，在一定范围内，随着提取时间的延长，籽瓜多糖的得率先增大后减小，在20 min 时达到最大。这是由于微波效应使水分子发生高速震荡、自旋，增大了溶剂进入溶质内部的能力原料的细微组织结构发生变化，多糖更容易从基质中释放出来，使得整个提取时间缩短，提取率增高。处理时间过短，多糖溶解不充分;如果时间过长，会造成多糖降解，甚至使其中的五碳环或六碳环裂解而转变为可溶于乙醇的单糖、寡糖或低聚糖，在醇沉过程中有所损失，最终会导致提取率的下降［5］。因此确定提取时间为20 min。

图1 提取时间对多糖得率的影响Fig.1 The effect of extract times on the yield of polysaccharide

2.1.2 微波提取温度对多糖得率的影响

由图2 可知，温度对于籽瓜多糖的提取有着显著的影响。随着温度的增加，籽瓜多糖得率呈现先增加后减小的趋势，在30 ～60℃时，籽瓜多糖得率随温度的增加而增加，并且多糖得率在60℃时达到最大，在一定范围里，提取温度升高，有利于分子的运动和多糖的溶出;但温度过高则会影响到多糖的结构，反而会使多糖得率降低。因此最终确定提取温度范围是60℃。

图2 提取温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.3 液料比对多糖得率的影响

由图3 可知，随料液比的增加，籽瓜多糖得率呈现先增加后减小的趋势，这是因为，液料比低时，多糖溶解不充分，故得率低;随着液料比增高，多糖充分溶胀，有利于多糖的溶出，使得率增加。但是，液料比过大，使后续中的浓缩时间增加，必然使多糖在浓缩过程中有较多损失，反而使多糖得率下降［6］。由图可知，料液比在1∶1 时，籽瓜多糖得率最佳。

图3 料液比对多糖得率的影响Fig.3 The effect of ratio of material on the yield of polysaccharide

2.1.4 微波功率对多糖得率的影响

由图4 可知，在100 ～300W 功率内，籽瓜多糖的得率随着微波功率的增加逐渐增大，但是当功率大于300W 时，多糖得率呈现非常明显的下降趋势。这可能是因为，微波功率增大，细胞内温度升高使细胞内部压力升高，细胞破裂使得细胞内的物质大量流出。而当功率过大时，局部温度过高，使多糖结构遭到破坏，导致提取率的下降［7］。因此最终确定提取功率是300W。

图4 微波功率对多糖得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the yield of polysaccharide

2.2 响应面法优化微波辅助提取籽瓜多糖的工艺

2.2.1 模型方程的建立与显著性检验

分别以多糖提取率为响应值Y，通过SAS 软件对试验资料进行响应面分析(表2)，经二次回归拟合后求得响应函数，即可得到回归方程如下:

对回归方程进行方差分析和模型系数显著性检验(表3、表4)。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 RSM design matrix and the responses

续表2

如表2 所示，共29 个试验点，其中24 个为析因点，5 个为零点，析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，其中零点试验重复5 次，用以估算试验误差。

表3 回归模型显著性检验及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis for the regression model

由方差分析(表3)可以看出，模型Prob ＞F 值小于0.05，表明该模型方程极显著，不同处理间的差异高度显著，说明这种实验方法是准确可靠的. 采用F检验方法对模型的显著性进行分析，F 值为6.75，p值小于0.01，表明模型是极显著的，可以采用回归模型对响应值进行预测。

回归模型的回归模型的R2为0.871 0，说明模型的拟合度很好，响应值的87.1%的是由于所选变量引起的，使用该方程模拟真实的四因素三水平的分析是可行的。由表4 的分析结果可以看出各因素中一次项XI、X2、X3、X4不显著，二次项中X21、X22、X23、X24 是极显著的，但是交互项XI X2、XI X3、XI X4、X2X3、X2X4、X3X4不显著，表明各因素对响应值的影响没有明显的交互作用。可以用该模型方程来分析和预测不同提取条件下籽瓜多糖的得率的变化。2.2.2 响应面结果分析

表4 多糖得率回归模型系数的显著性检验Table 4 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

根据多糖得率回归模型作出相应的响应面和等高线见图5 ～图10，三维球面图与二维等高曲线图很形象地描述了二次回归方程。通过三维图与曲线图，能很容易的看出实验水平与每个变量或是变量之间的交互影响的响应值之间的关系。等高线的形状(圆形、椭圆形)表明了变量之间的交互影响是否显著。圆形的等高线表明两变量之间的交互影响是不显著;椭圆形的等高线表明两变量之间的交互影响是显著的。比较图响应面最高点和等高线可知，在所选各因素水平范围内存在极值，即响应面最高点，同时也是等高线最小椭圆的中心［8］。

图5 是温度和时间交互作用对多糖得率的影响。由图可知温度和时间两者间的交互影响比较显著。当料液比为1∶1，功率是300W 时，随着提取时间的增加，多糖得率也增大，时间越长得率越大，随着提取温度的升高，多糖得率先升高后降低。但是提取温度过高、时间过长会导致一些大分子多糖的降解。

由图6 可知，提取时间和料液比对多糖得率的交互影响较为显著。在提取温度为60℃，微波功率为300W 时，多糖得率的变化速率显示料液比的效应大于时间。随着提取时间的增加，多糖得率也慢慢增大，提取时间过长会导致多糖发生水解，多糖得率也会减小。随着料液比的增加，多糖得率是先增大后减小。料液比小细胞内升温快，破壁效应大，多糖得率大，随着料液比的增加，损失在提取介质中的微波能越来越多，细胞内的温度升高缓慢，破壁效应减小，多 糖得率减小。因此料液比过大不利于多糖的提取。

图5 温度、时间及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and time on the yield of polysaccharide

图6 时间、料液比及其交互作用对得率影响的等高线和响应面Fig.6 Response surface plot and contour plot of the combined effects of time and ratio of material on the yield of polysaccharide

图7 时间、功率及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface plot and contour plot of the combined effects of time and microwave power on the yield of polysaccharide

图7 的结果显示，当提取温度为60℃，料液比为1∶1 时，多糖得率的变化速率显示功率的主效应大于时间。随着提取时间的延长多糖得率慢慢增大，时间长多糖溶出率增大;随着功率的增大，多糖得率逐渐增大，而在功率达到一定时，随着提取时间的增加，多糖得率又呈现出下降的趋势。

由图8 可知，提取温度和料液比的相互交互作用较强。在提取时间为20 min，微波功率为300 W 时，随着温度的升高多糖得率也不断升高，且温度越高升高速率越快，但温度过高时多糖得率又慢慢变小，这是因为温度过高导致大分子多糖降解，多糖得率减小;随着料液比的增加多糖得率呈现先增大后减小的趋势，这主要是因为料液比影响液相主体和固相主体之间的浓度差造成的。

图9 的结果显示，随着功率的增大，多糖得率逐渐增大;而当功率增加到一定数值时，随着温度以及提取时间的增加，多糖得率呈现下降的趋势。在较高的提取温度下，受到微波辐射效应的影响，多糖容易从细胞中游离出来，但是温度过高会导致多糖发生水 解使得多糖得率降低。

图8 温度、料液比及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and ratio of material on the yield of polysaccharide

图9 温度、功率及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.9 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and microwave power on the yield of polysaccharide

图10 功率、料液比及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.10 Response surface plot and contour plot of the combined effects of microwave power and ratio of material on the yield of polysaccharide

由图10 可知，在提取时间和提取温度分别为20 min 和60℃时，料液比和微波功率对多糖得率的影响都是先增加后减少。随着微波功率慢慢增大，细胞的破壁效应逐渐增大，有利于细胞内部糖的溢出，微波功率过大又会使多糖发生降解;随着料液比增大，液相中糖的浓度增大，多糖得率增加，料液比过高会使细胞内温度升高缓慢，不利于糖的溶出，多糖得率降低。

2.2.3 优化提取参数和验证模型

表5 最优条件与最优条件下的预测、实际值Table 5 Optimum conditions and the predicted and experimental value of response at the optimum conditions

由SAS 分析得到最大响应值与其相对应的籽瓜多糖的最佳提取条件为∶时间为19.58min，功率为302.5W，温度为62.37℃，料液比为1∶0.92，理论最佳提取率为4.599%。为了检验响应面法的可行性，采用得到的最佳提取条件进行籽瓜多糖微波辅助提取的验证实验，同时考虑到实际操作和生产的便利，因此将微波辅助提取籽瓜多糖的各个实验因素条件修订为:时间为19.5 min，功率为302W，温度为62℃，料液比为1∶0.9。经过5 次平行实验，得到的实际平均提取率为4.55%.

2.3 籽瓜多糖的红外光谱扫描

图11 是籽瓜多糖在4 000 ～400 cm－1的红外光谱图谱。3 408 cm－1处为—OH 伸缩振动峰，而2 928 cm－1和1 408 cm－1处的2 组吸收峰分别代表了C—H的伸缩振动和变角振动，基本可以确认SWP 是糖类化合物［9］。1 645.08 cm－1处的吸收峰可能是—CHO中C=O 的伸缩振动。1 0 7 4 cm－1处的吸收峰为C—O—H 中的—OH 的变角振动［11］。

图11 籽瓜多糖的红外图谱Fig.11 FTIR spectra of Seed Watermelon polysaccharide

2.4 籽瓜多糖的单糖组成分析

由GC-MS 分析得到籽瓜多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六种单糖组成，归一化法得出各组分摩尔比为:4.48∶13.14∶4.16∶7.82∶10.1∶60.3。

图12 标准单糖的GC 图和籽瓜多糖的GC 图Fig.12 The GC photo of the standard monosaccharide and the GC photo of SWP

3 结论

(1)通过单因素实验和响应面优化得到微波辅助提取籽瓜多糖的最佳提取条件为∶时间为19.58 min，功率为302.5W，温度为6 237℃，料液比为1∶0.92，提取率为4.599%。考虑到实际操作的可控性，将响应面优化得到的微波辅助提取籽瓜多糖的最佳工艺条件修订为:时间为19.5 min，功率为302W，温度为62℃，料液比为1∶0.9。经过5 次平行实验，得到的实际平均提取率为4.55%。

(2)运用GC-MS 对籽瓜多糖的单糖组分进行分析表明，籽瓜多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 种单糖组成，归一化法得出各组分摩尔比为4.48∶13.14∶4.16∶7.82∶10.1∶60.3。

［1］ 孙亦农. 籽瓜瓤和皮的综合利用［J］． 食品科学，1999(4):75 －76.

［2］ 王翠平. 籽瓜抗氧化及抗肿瘤活性研究［J］． 安徽农业科学，2011，(39)29:17 833 －17 836.

［3］ 申利红，王建森，李雅等. 植物多糖的研究及应用进展［J］． 中国农学通报，2011，27(02):349 －352.

［4］ 刘志明，唐彦君，吴海舟，等. 苯酚-硫酸法测定葡萄酒中总糖含量的样品处理［J］． 中国酿造，2011，27(2):158 －161.

［5］ Zhao Baotang，Zhang Ji，Guo Xiao，et al．Microwave-assisted extraction，chemical characterization of polysaccharides from Lilium davidii var.unicolor Salisb and its antioxidant activities evaluation［J］． Food Hydrocolloids，2013，31:346 －356.

［6］ Wang Junlong，Zhang Ji，Wang Xiaofang，et al. A comparison study on microwave-assisted extraction of Artemisia sphaerocephala polysaccharides with conventional method:Molecule structure and antioxidant activities evaluation［J］． International Journal of Biological Macromolecules，2009(45):483 －492.

［7］ Wang Junlong，Zhang Ji，Zhao Baotang，et al.A comparison study on microwave-assisted extraction ofPotentilla anserineL. polysaccharides with conventional method:Molecule weight and antioxidant activities evaluation［J］． Carbohydrate Polymers，2010(80):84 －93.

［8］ 朱彩平，高贵田. 响应曲面法优化微波辅助提取平菇多糖工艺研究［J］． 食品科学，2010，31(4):68 －72.

［9］ Sophie Aboughe Angone，Muriel Bardor，Eric Nguema-Ona，et al.Structural charac-terization of cell wall polysacchar ides from two plant species endemic to central Africa，Fleury aestuans andPhragmenthera capitata［J］． Carbohydrate Polymers，2009(75):104 －109．

［10］ Jinwei Li，Liuping Fan，Shaodong Ding. Isolation，purification and structure of a new water-soluble polysaccharide fromZizyphus jujubacv. Jinsixiaozao［J］． Carbohydrate Polymers，2011(83):477 －482.

［11］ Kui Zhong，Qiang Wang. Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology［J］． Carbohydrate Polymers，2010(80):19 －25.

［12］ 胡亚男，王义明，罗国安. 质谱在糖分析中的应用［J］． 药学学报，2000，35(5):397 －400．

［13］ 陈海华，许时婴，王璋. 亚麻籽胶中的中性多糖NFG－1 一级结构的研究［J］． 食品与生物技术学报，2001，26(1):65 －66．

［14］ 金迪. 黄芩多糖的提取及其生物活性研究［D］． 哈尔滨:黑龙江八一农垦大学硕士学位论文，2012.