生命钻石牌藏福康软胶囊增强免疫力功能实验

曲艳梅

(东北虎药业股份有限公司,吉林 吉林 132013)

·论 著·

生命钻石牌藏福康软胶囊增强免疫力功能实验

曲艳梅

(东北虎药业股份有限公司,吉林 吉林 132013)

目的生命钻石牌藏福康软胶囊增强免疫力功能检测。方法健康雌性ICR小鼠，采用脾淋巴细胞增殖能力、抗体生成细胞数、血清溶血素水平、腹腔巨噬细胞吞噬能力、单核-巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性及对脾脏/体重和胸腺/体重比值、足跖肿胀度试验等方法。结果与对照组比较，足跖肿胀度、脾脏/体重和胸腺/体重比值无显著性差异；对脾淋巴细胞转化，低、高剂量组抗体生成细胞数，高剂量组血清溶血素水平，高剂量组单核-巨噬细胞碳廓清吞噬指数，中、高剂量组腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，高剂量组NK细胞活性均有显著性差异(P<0.05)。结论本品经免疫力功能测定实验结果提示其具有增强免疫力的作用。

藏福康软胶囊;增强免疫力;功能实验

生命钻石牌藏福康软胶囊是以人参果[1-2]、刺五加[3-6]、小麦胚芽油[7-8]为主要原料制成，其保健功能为增强免疫力、提高缺氧耐受力功能。且经毒理安全性评价实验证明其安全可靠。现将增强免疫力功能检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1样 品由吉林市新科奇保健食品有限公司提供，为黄褐色液体。

1.2实验动物

北京维通利华实验动物技术有限公司，健康雌性ICR小鼠，体重18～22 g，批准文号为SCXK(京)2002-0003，共192只，分为4组，免疫一组进行碳廓清实验；免疫二组进行脏器/体重比值、迟发型变态反应(DTH)、抗体生成细胞检测及血清溶血素测定；免疫三组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫四组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定实验。

1.3剂量选择

生命钻石牌藏福康软胶囊人体推荐量为每天3.0 g/(人·日)，按人均体重60 kg计，实验设低、中、高3个剂量组，即：0.25 g/(kg·bw)、0.50 g/(kg·bw)、1.50 g/(kg·bw)，分别相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍。即称取样品0.50 g、1.0 g、3.0 g用植物油分别配至20 mL。溶剂对照组灌胃植物油，各组小鼠都按每天0.1 mL/(10 g·bw)剂量连续经口灌胃30 d后，测各项免疫指标。

1.4仪器与试剂

紫外可见分光光度计、电子天平、数显游标卡尺(精密度0.01 mm)，微量注射器(50 μL)、CO2培养箱、恒温水浴箱、离心机、酶标仪、显微镜、玻片架、200目筛网、手术器械、秒表、一次性定量取血管、24孔和96孔细胞培养板。SRBC、补体(豚鼠血清)、Hanks液、SA缓冲液、琼脂糖、印度墨汁、Na2CO3溶液、都式试剂、YAC-1细胞、RPM11640完全培养液、乳酸锂、INT、PMS、NAD、0.2 mol/L Tris-HCL缓冲液、1%NP40、ConA、1%冰醋酸、MTT液、酸性异丙醇、1 mol/L HCL溶液、PBS缓冲液、Giemsa染液等。

1.5实验方法

1.5.1DTH检测:足跖增厚法

小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC，致敏后4 d测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC，每鼠注射20 μL，注射后24 h测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。

1.5.2Con诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Hanks液洗2次，每次离心10 min(1 000 r/min)，将细胞悬浮于1 mL RPMI1640完全培养液中，调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作为对照，置5% CO2、37 ℃培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640完全培养液，同时加入MTT 50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，在570 nm波长处测定OD值，以加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞增殖能力。

1.5.3小鼠脏器/体重比值及血清溶血素测定

小鼠脏器注射SRBC 5 d后，摘眼球取血，离心取血清稀释100倍，进行半数溶血值测定。然后处死动物，取胸腺、脾脏称重，计算脏器/体重比值。同时制备脾细胞悬液，进行抗体生成细胞测定。

1.5.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

取脾，制成细胞悬液。将表层培养基加热溶解后与等量双倍Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50 μL 10% SRBC(v/v，用SA液配制)、20 μL脾细胞悬液，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将破片水平扣放在玻片架上，放入CO2培养箱温育1.5 h，然后用SA液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5 h后，计数溶血空斑数。

1.5.5小鼠碳廓清试验

小鼠尾静脉注射1∶3稀释的印度墨汁，待墨汁注入立即计时，注入墨汁后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，并将其加到2 mL Na2CO3溶液中，用紫外可见分光光度计在600 nm波长处以Na2CO3溶液作空白对照测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝和脾脏称重，计算吞噬指数。

1.5.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min处死，固定于鼠板上，剪开腹壁皮肤，注射生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，分滴于2片玻片上，37 ℃温育30 min，用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa染液染色3 min，用蒸馏水漂洗晾干，用油镜镜检，计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬百分率(%)=

1.5.7NK细胞活性测定

实验前24 h将靶细胞传代培养，应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Hanks液洗2次，每次离心10 min(1 000 r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水裂解红细胞，20 s后再加入0.5 mL 2倍Hanks液及8 mL Hanks液，离心10 min(1 000 r/min)，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，调整细胞浓度为2×107个/mL。将靶细胞加入96孔培养板，每孔100 μL，试验孔加入100 μL脾细胞(效靶比50∶1)，自然释放孔加入100 μL培养液，最大释放孔加入100 μL 1%NP40，37 ℃培养4 h，离心，取上清100 μL置96孔酶标板中，加入LDH基质液100 μL，反应6 min，以1 mol/L的HCL终止反应，在酶标仪490 nm处测定值OD值。

NK细胞活性(%)=

1.6数据统计分析

试验数据以SPSS软件进行统计分析，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法(Dunnett检验法)进行比较。

2 结 果

软胶囊对小鼠DTH的影响结果显示，足跖肿胀度低剂量组(0.33 mm±0.10 mm)、中剂量组(0.33 mm±0.21 mm)、高剂量组(0.31 mm±0.16 mm)与对照组(0.25 mm±0.17 mm)比较无显著性差异,P>0.05。

软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验的影响结果显示，淋巴细胞增殖能力(OD差值)低剂量组(0.50±0.09)、中剂量组(0.48±0.07)、高剂量组(0.46±0.10)与对照组(0.27±0.09)比较均有显著性差异,P<0.05。

软胶囊对小鼠脏器/体重比值的影响由结果可见，各剂量组对小鼠的脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与对照组比较无显著性差异P>0.05(表1)。

软胶囊对小鼠抗体生成细胞数的影响结果显示，溶血空斑数(×103/全脾)低剂量组(27±9)和高剂量组(23±9)与对照组(14±8)比较均有显著性差异,P<0.05;中剂量组(18±7)与对照组比较无显著性差异,P>0.05。

软胶囊对小鼠血清溶血素的影响结果显示，半数溶血值(HC50)高剂量组(60±15)与对照组(40±14)比较均有显著性差异,P<0.05;低剂量组(57±19)和中剂量组(47±21)与对照组比较无显著性差异,P>0.05。

软胶囊对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的影响结果显示，吞噬指数(a)高剂量组(5.3±1.0)与对照组(4.5±0.5)比较均有显著性差异,P<0.05;低剂量组(4.9±0.6)和中剂量组(4.9±0.6)与对照组比较无显著性差异,P>0.05。

软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响结果显示,中、高剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，与对照组比较有显著性差异,P<0.05(表2)。软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响结果显示，NK细胞活性(%)高剂量组(65.8±17.0)与对照组(48.6±16.4)比较均有显著性差异,P<0.05;低剂量组(62.3±12.7)和中剂量组(58.3±12.8)与对照组比较无显著性差异,P>0.05。

软胶囊对小鼠体重的影响结果显示，小鼠的初始体重在低、中、高剂量组与对照组比较无显著性差异,P>0.05，即小鼠的初始体重在各组之间较为均衡。而实验期间小鼠体重增重在低、中、高剂量组与对照组比较无显著性差异,P>0.05,即软胶囊对小鼠体重无影响(表3)。

表 1 软胶囊对小鼠脏器/体重比值的影响(n=12，g/100g)

表 2 软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

与对照组比较,*P<0.05

表 3 软胶囊对小鼠体重的影响(n=12,g)

3 结 论

实验结果表明，生命钻石牌藏福康软胶囊能提高小鼠的脾淋巴细胞增殖能力、增加抗体生成细胞数、提高血清溶血素水平、增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力、增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能、增强小鼠NK细胞活性；对脾脏/体重比值、胸腺/体重比值、足跖肿胀度无影响；提示生命钻石牌藏福康软胶囊具有增强免疫力的作用。

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TheresearchofLifediamondzangfukangsoftcapsulesinenhancingimmunity

QU Yan-mei

(The Northeast Tiger Pharmaceutical Company,Jilin City,Jilin Province,132013，China)

ObjectiveTo detect the function of Life diamond zang fu kang soft capsules in enhancing immunity.MethodsThe healthy female ICR mice were applied in the observation of immunity function include the spleen lymphocyte proliferation,antibody generation,the level of serum hemolysin,the capacity of macrophage cell in abdominal cavity,mononuclear macrophage phagocytosis,the activity of NK cells,the spleen and thymus weight/body weight ratio,as well as foot metatarsus swelling degree.ResultsCompared with the control group,the capsules group has no significant difference in the foot metatarsus swelling degree,spleen and thymus weight/body weight ratio;For spleen lymphocyte transformation,the antibody generating cell number of low and high dose group,the serum hemolysin level of high dose group,the mononuclear-macrophages carbon clearance index of high dose group,and the index of phagocytosis macrophage cell in abdominal cavity rate of middle and high dose group,NK cell activity of high dose group were significantly different from the control group(P<0.05).ConclusionThis product can enhance the immunological function.

Life diamond zang fu kang soft capsules;enhancing immunity;detect the function

R285

A

2013-08-24)

1673-2995(2013)06-0419-04

曲艳梅(1973-)，女(汉族)，工程师，高级经济师,本科.