独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL蛋白表达的影响

万春飞，詹秀琴，孙玉明*

(1.南京中医药大学 第一临床医学院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210029)

·实验研究·

独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL蛋白表达的影响

万春飞1，詹秀琴2，孙玉明1*

(1.南京中医药大学 第一临床医学院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210029)

目的:检测独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL蛋白表达的影响，从分子生物学层面探究独活寄生汤治疗骨质疏松症的机理，为独活寄生汤治疗骨质疏松症提供理论及实验依据。方法：体外培养原代SD新生24 h大鼠成骨细胞，分别用生理盐水血清对照组、独活寄生汤含药血清低浓度，中浓度，高浓度作用于成骨细胞,采用MTT法检测独活寄生汤含药血清对成骨细胞生长的影响，Western Blot检测独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达的影响。结果：独活寄生汤含药血清以浓度及时间的依赖方式促进成骨细胞生长；Western Blot结果显示不同浓度的独活寄生汤含药血清能促进成骨细胞OPG蛋白的表达，并且抑制成骨细胞RANKL蛋白的表达。结论：独活寄生汤含药血清可以通过OPG、RANKL系统促进成骨细胞的增殖并且影响成骨细胞的分化。

独活寄生汤;成骨细胞;骨保护蛋白;核因子-κB受体活化子配体

骨质疏松症是一种以骨量减少，骨组织显微结构退化为特征，以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病[1]，该病发病率高，且容易合并严重并发症[2-3]。近20年来，国内广泛开展了中医中药及中西医结合防治骨质疏松症的研究，一些研究者探索了单味中药和从单味中药中提取的化学成分对治疗骨质疏松症取得了一定的成果，其中，中药葛根及其有效成分葛根素在治疗骨质疏松症的方面取得了一定的成绩。前期研究[4-5]表明给予原发性骨质疏松症患者口服葛根素，每日30 g连续28 d，结果显示骨质疏松症患者在VAS、活动能力、腰和背静息痛等方面均较治疗前有明显的改善,且ALP、BGP、U-Ca/U-Cr、U-Hop/U-Cr等指标都有所下降，E2指标有所上升，其中BGP、U-Hop/U-Cr、U-Hop/U-Cr、E2等指标与每日口服αD30.5 μg对照有显著性差异。独活寄生汤源于中医经典名著《备急千金要方》，主要治疗痹证日久、肝肾两虚、气血不足等证，现临床多见于治疗类风湿性关节炎[6]、强直性脊柱炎[7]、腰椎管狭窄症[8]、腰椎间盘突出症[9]、膝骨性关节炎[10]及产后身痛[11]等证，尚未见独活寄生汤治疗骨质疏松症方面文章，更未见其对骨质疏松的作用机理研究的文章。独活寄生汤方有补益肝肾、补脾健脾、活血养血、祛风除湿、蠲痹止痛的功效，其所主治之证与骨质疏松症的肾虚、脾虚、血瘀3个病机要素完全相对应[12]，在此理论下进行实验研究，证明独活寄生汤对由骨质疏松症引起的慢性腰、背疼痛有一定的治疗效果。由此在临床研究的基础上探讨独活寄生汤对成骨细胞OPG/RANKL基因表达的影响，从分子生物学层面探索独活寄生汤治疗骨质疏松症的原理，为独活寄生汤治疗骨质疏松症提供可靠的理论依据。

1 实验材料

1.1 成骨细胞体外培养 通过酶消化法从新生24 h内SD大鼠颅盖骨分离提取成骨细胞。乳鼠10只75%乙醇中浸泡10 min；切下颅盖骨置于D-Hanks液内;清除骨膜、血管以及结缔组织，用D-Hanks液洗净颅盖骨，剪成1 mm×1 mm大小的骨片置于0.25%胰蛋白酶溶液中消化20 min；将消化后的颅盖骨片移入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中振荡40 min；将含细胞的消化液1 000 r/min离心10 min，吸去上清，细胞团块用培养液制成细胞悬液，接种于培养瓶，并放于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每1～2 d换液1次直至90%细胞融合，常规消化细胞进行传代。选择第2代细胞用于实验。[13]

1.2 含药血清制备 取独活寄生汤水煎液浓缩，药物浓度分别相当于生药含量为2.84、4.73、7.56 g/mL，大鼠给药量为1 mL/100 g体质量，1次/d,经人-大鼠体表面积比值折算，相当于成人日用临床剂量的3、5、8倍。取6月龄雌性SD大鼠(200±5)g，20只，随机分为4组，分别灌服生理盐水和低剂量、中剂量、高剂量独活寄生汤浓缩制剂，给药量为1 mL/100 g 体质量，1次/d，连续5 d，末次给药后1 h，乙醚麻醉，无菌条件下，腹主动脉取血，低温放置1 h,2 500 r/min离心25 min分离血清，得到生理盐水组血清(A)、独活寄生汤含药血清低剂量组(B)、中剂量组(C)及高剂量组(D)，-20℃冰箱保存备用。[14]

1.3 主要试剂 DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(GIBCO,USA)，消化剂为0.25%的胰蛋白酶(MERCK，USA)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)以及其他抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.4 主要仪器 CO2培养箱(SANYO,USA)，全自动酶标光度计，蛋白电泳槽，电转移装置(BIO-RAD，USA)，三洋超低温冰箱(JAPAN)，TE300倒置相差显微镜(Nikon公司)，三用电热恒温箱(国营江苏淮阴医疗器械厂)，隔热恒温培养箱(上海跃进医疗器一厂)，电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 成骨细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养液,37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，细胞单层铺满培养瓶后，用0.25%胰酶消化，2～3 min后，镜下观察细胞圆缩时，吸管吹打使细胞悬于液体中，加10%FBS培养液终止消化，加入适量培养液，分瓶培养。

2.2 噻唑蓝还原法(MMT法)测定细胞生长促进率 在无菌条件下,取对数生长期的成骨细胞，用0.25%的胰酶消化,制成单细胞悬液。调整浓度，将细胞浓度调整为1×104/mL密度接种于96孔培养板，每孔加200 μL10%培养液，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待成骨细胞贴壁后，弃上清液，每组设6个复孔,各孔加入DMEM 180 μL，实验组中的生理盐水血清组、独活寄生汤含药血清低剂量、中剂量、高剂量组加入不同浓度的药物，每孔各加20 μL，加药后继续培养12、24、48 h，分别每孔加20 μL浓度为5 mg/mL的MTT,继续培养4 h后，弃上清液，各孔加150 μL的DMSO,轻度振荡约10 min使其溶解，酶标仪于490 nm波长处测定吸光值(OD值)，计算在不同时间时，低剂量组、中剂量组、高剂量组对成骨细胞的促进率,重复3次。按公式计算细胞生长促进率(IR)=(独活寄生汤含药血清组平均OD值-空白血清组平均OD值)/空白血清组平均OD值×100%。

2.3 Western Blot检测OPG/RANKL蛋白表达 将成骨细胞用0.25%的胰酶消化后，按照1×104/瓶的细胞密度接种于25 mL培养瓶中,培养细胞贴壁后,分别加入4 mLDMEM培养液,后加入独活寄生汤低剂量、中剂量、高剂量溶液；对照组加入5 mL的DMEM培养液，继续于培养箱中培养48 h后,提取各组细胞总蛋白,并用BCA法测定蛋白浓度,加热变性后-20 ℃保存。取各组细胞的总蛋白70 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳,将分离后的蛋白质电转移到PVDF，用封闭液封闭滤膜4 h,按大约0.1 mL/cm2的量加入封闭液、适量一抗兔抗大鼠OPG(1∶500)、兔抗大鼠RANKL(1∶800)，兔抗大鼠β-actin(1∶5 000)。摇床振荡培养(4 ℃，过夜)。PBST充分漂洗滤膜4次，每次10 min。将膜与HRP结合的二抗(辣根过氧化酶标记羊抗兔,二抗用封闭液稀释)(1∶5 000)室温下振荡培养2 h，用PBST洗膜,充分漂洗4次，每次10 min。按照0.1 mL/cm2显影液计算用量，将显影液加于NC膜上，室温放置1 min。用保鲜膜将膜包好，暗室中迅速将膜蛋白贴在X线胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间,直到出现最佳条带。

3 实验结果

3.1 独活寄生汤含药血清促进成骨细胞的增殖 见表1。如表1所示,成骨细胞经独活寄生汤含药血清作用后，细胞的生长呈现不同程度的增殖，并且呈时间、浓度依赖性的特点。

表1 独活寄生汤含药血清对成骨细胞生长的促进作用

注：与生理盐水组相比，▲P<0.05。

3.2 独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL相关蛋白表达的影响 成骨细胞经过独活寄生汤含药血清低剂量、中剂量、高剂量作用24 h后，Western Blot分析表明，如图1～3所示，与生理盐水组血清相比，RANKL表达明显降低，OPG表达明显升高。

4 讨论

目前在骨质疏松症的研究领域已进入到分子生物学的水平，尤其在基因复制、蛋白定量、信号通道等方面进行了深入广泛地实验研究。骨保护蛋白(Os-teoprotegerin，OPG)、核因子-κB受体活化子配体(receptor activator of NFKB ligand，RANKL)和核因子-κB受体活化因子(recetptor activator of NK-kb，RANK)是近年发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族中的几个成员[15]，相关实验研究表明通过调节OPG、RANKL、RANK的表达调控破骨细胞，从而调控骨吸收，成为骨吸收和骨重建的关键因素。其中OPG、RANKL都由成骨细胞、基质细胞表达，是破骨细胞分化、调节的信号因子,与骨代谢相关几乎所有重要的激素和细胞因子均可以通过调控OPG、RANKL的表达，从而达到调节骨重建的目的。

图1 独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL相关蛋白表达的影响

图2 OPG/β-actin值

图3 RANKL/β-actin值

研究表明RANK存在于破骨细胞前体细胞膜表面，是激活前体细胞和分化成破骨细胞最重要的信号通道，而由成骨细胞分泌的RANKL能激活该信号通道，直接刺激破骨细胞分化,并且与破骨细胞表面受体RANK结合，进而促进破骨细胞的形成、分化、成熟，并且能够抑制破骨细胞的凋亡，延长破骨细胞存活时间,所以RANKL对于破骨细胞的分化是必需的[16]。本实验研究Western blot结果显示，与生理盐水血清组相比，独活寄生汤含药血清组成骨细胞RANKL蛋白的表达显著下调,由此可以说明独活寄生汤含药血清可能通过抑制成骨细胞表达RANKL，抑制了破骨细胞的活性，进而达到治疗骨质疏松的目的。

OPG是一种由成骨细胞分泌的肝素结合分泌型糖蛋白，作为RANKL的可溶性诱饵受体，OPG对RANKL的竞争结合能力比RANK强，所以能通过与RANKL竞争性结合RANK，从而阻断RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，从而阻断骨吸收信号的传递，抑制破骨细胞的分化和成熟，诱导破骨细胞的凋亡。实验结果显示，与生理盐水血清组相比，独活寄生汤含药血清组成骨细胞OPG的表达明显升高，由此可以说明独活寄生汤含药血清可能是通过促进成骨细胞表达OPG，增加与RANKL的结合，抑制破骨细胞的功能，而达到治疗骨质疏松的目的。

在本研究中,通过体外实验观察了独活寄生汤对成骨细胞OPG/RANKL信号通路相关蛋白的表达的影响。研究结果表明，独活寄生汤含药血清具有促进成骨细胞生长的作用，促进成骨细胞OPG的表达，并且抑制RANKL基因的表达。可见，独活寄生汤含药血清可能是通过促进成骨细胞OPG的表达，抑制RANKL的表达，通过阻断骨吸收信号的传递，阻止破骨细胞的激活、分化，抑制破骨细胞的活性，促进破骨细胞的凋亡，达到治疗骨质疏松症的目的。

通过本次研究，根据独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL基因表达的影响,笔者推测独活寄生汤应该可以治疗其他代谢性骨病及相关疾病，这也进一步拓展了独活寄生汤的治疗范畴。

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EffectofMedicatedSerumofDuhuojishengDecoction(独活寄生汤)onthemRNAExpressionofOsteoprotegerinandReceptorActivatorofNF-κBLigand(RANKL)inOsteoblasts

WAN Chun-fei1,ZHAN Xiu-qin2,SUN Yu-ming1

(1.The First Clinical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China;2.The Pre-clinical Medicine college,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China)

ObjectiveTo investigate the effects of serum containing substances of a Chinese traditional drug,Duhuojisheng Decoction,on expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)in osteoblasts,and to study the mechanism of action of Duhuojisheng Decoction treatment for osteoporosis.MethodsOsteoblasts were obtained from new born rat calvaria by collagenase-trypsin digestion.Four groups were included in the experiment and situ hybridization method was used to detect the expression of OPG and RANKL.ReaultsCompared with the normal serum group,the expression of OPG in osteoblasts in the serum of Duhuojisheng Decoction increased significantly,while the expression of RANKL decreased remarkably.ConclusionThe serum containing Duhuojisheng Decoction could not only inhibit the secretion of RANKL to repress the activity of osteoclast but also stimulate osteoblasts to secrete OPG,then the combination of OPG and RANKL increased,which could reduce the activity of RANKL and decresed the activity of the bone resorbing activity of obsteoclasts consequently.It may be one of the mechanism of actions of Duhuojisheng Decoction for treating osteoporosis.

DuhuojishengDecoction;Osteoblast;OPG;RANKL

R681.4

A

1003-5699(2013)01-0066-04

2012-09-05)

江苏省老中医药专家学术经验继承专项研究课题(序号：8)。

万春飞(1985-)，男，硕士研究生。研究方向：骨质疏松症方向。

*通信作者：孙玉明，Tel：13813831688，E-mail:sunyumingliuxq@126.com。