香菇紫金Ⅰ号产木聚糖酶固体发酵条件及酶学性质研究

2013-10-24 10:17王海燕
关键词:产酶聚糖氮源

王海燕,冯 炎

(金陵科技学院)

0 引言

啤酒糟,是以大麦为原料,经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣.啤酒糟含有丰富的蛋白质、氨基酸及微量元素,谢幼梅等(1995)分析指出,啤酒糟干物质中含粗蛋白25.13%、粗脂肪7.13%、粗纤维13.81%、灰分3.64%、钙0.4%、磷0.57% ,其中无氮浸出物的主要成分是木聚糖.基于此,一些专业科研人员深入的探究了啤酒糟的利用价值,如制备功能性乳酸发酵纤维饮料所需的膳食纤维可从啤酒糟中提取;复合氨基酸营养液、蛋白饲料可利用啤酒糟发酵来生产等.[1-3]该试验试图在添加其他辅料情况下,以啤酒糟作为主要原料,香菇紫金I号为菌种,在固态发酵条件下,研究了不同培养条件、不同培养基成分对木聚糖酶活性的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)菌种.香菇紫金I号来自金陵科技学院发酵工艺实验室.

(2)原料.啤酒糟由青岛啤酒股份有限公司扬州分厂提供.

1.2 试剂及配置

1.2.1 缓冲液

配制浓度为0.05 mol/L、pH为2.5~6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和pH为6.5~7.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,用精密pH计校正.

1.2.2 培养基

(1)斜面培养基:磷酸二氢钾(KH2PO4)1 g、马铃薯200 g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g、蛋白胨 10 g、琼脂20 g、VB12 粒、葡萄糖 20 g、水1000 mL、自然pH,于121℃下灭菌20 min.

(2)液体种子培养基:啤酒糟3g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1 g、蛋白胨10 g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g、马铃薯 200 g、水1000 mL、自然pH,于121℃下灭菌20 min.

(3)固体发酵培养基:硫酸镁0.05 g、啤酒糟8 g、硫酸铵0.1 g、磷酸二氢钾 0.05 g、麸皮 2 g,水30 mL,自然pH,121℃灭菌45 min.

1.2.3 底物的配制

1%的木聚糖溶液[4].精确称取燕麦木聚糖1 g于小烧杯中,加入约80 mL pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,沸水浴加热至全部溶解,冷却后转移到100 mL容量瓶中,用缓冲液定容,4℃贮存备用(不超过3 d).

1.2.4 DNS试剂

该试验参考Miller[5]的文献配置DNS试剂.

称取10 g DNS溶于去离子水,依次加入10 g氢氧化钠、200 g酒石酸钾钠,加热溶解后,加2 g苯酚、0.5 g无水亚硫酸钠,搅拌至全部溶解,冷却,定容至1 L,贮于棕色瓶中,1 W后使用.

1.3 实验方法

1.3.1 发酵过程

(1)斜面菌种培养.在斜面培养基上接种上香菇紫金I号2块菌丝,于25℃ 恒温培养箱进行培养,培养6~7 d.

(2)液体种子培养.将活化菌丝用无菌液体培养基进行清洗(无菌条件下),清洗后移入装有80 mL液体种子培养基中(在250 mL三角瓶中进行),于25℃、160 rmp的恒温摇床中培养6 d,备固态发酵培养基用.

(3)固态发酵.于5 g/125 mL三角瓶中进行,在基础发酵培养基中(已灭菌)接种上已发酵好的液体种子,接种量为干料的20%,置于25℃ 恒温箱中进行培养,培养10 d.

1.3.2 单因素试验设计

(1)不同碳源配比影响:将碳源分别替换为啤酒糟6 g、玉米芯2 g、麸皮 2 g;啤酒糟 8 g和玉米芯2 g;啤酒糟10 g.

(2)氮源的影响:按培养基干料比的1%的量,考察以下6因素对氮源的影响:硝酸铵、牛肉膏、硫酸铵、黄豆粉、酵母膏、玉米粉.

(3)pH不同的影响:考察(基础发酵培养基)起始 pH 分别为 4、5、6、7、8 时对酶活的影响.

(4)装瓶量不同的影响:在125 mL的三角瓶中进行,将基础发酵培养基按 3、5、7、9 g和11 g装入三角瓶中,考察5个不同梯度因素的影响.

(5)培养天数不同的影响:按5个梯度来设定 7、8、9、10 和 11 d.

(6)料水比不同的影响:料水比设定为1∶2.8、1∶3.2、1∶3.6、1∶4.0 和 1:4.4.

1.3.3 正交试验设计

选择碳源及组分配比,氮源添加量,pH,料水比,培养天数进行5因素、4水平的正交实验,见表1,对以上5个因素进行优化.

表1 因素与水平表

1.3.4 粗酶液制备及酶活测定

(1)粗酶液制备:将50 mL 0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.8)加入到固态发酵好的培养物中,浸泡2 h(40℃)后过滤,再取滤液进行冷冻离心,以6000 rmp离心15 min,取上清液即是粗酶液.

(2)木聚糖酶活力测定[6]:于15 mL干燥试管中加入0.1 mL上清液和1.9 mL 1%木聚糖溶液,放水浴锅30 min(40℃)后,加入3.0 mL DNS试剂终止反应,然后在沸水浴中进行5 min显色.冷却后用去离子水定容至15 mL摇匀.于波长520 nm下测定OD值.

该文酶活力单位定义:50℃、pH 4.8条件下,每分钟分解1%木聚糖溶液产生1 μg还原糖(以木糖)的酶量为一个木聚糖酶活力.即:

其中,N为稀释度,W为酶反应生成木糖的含量,μg;0.1为加酶量;30为酶解时间,min.

1.3.5 木聚糖酶酶学性质的研究

(1)酶的最适pH:用pH为3~8缓冲液配制木聚糖溶液,然后分别加入0.1 mL粗酶液,水浴30 min(30℃)后加入3.0 mL DNS试剂,终止反应,沸水浴5 min显色,冷却后用蒸馏水定容到15 mL,摇匀.空白样对照:将酶液稀释沸水浴15 min令其失活,测吸光度(其他条件不变),计算其残余木聚糖酶活力.

(2)酶的最适温度:实验分别在 30、40、50、60、70和80℃的条件下,按1.3.4.2方法将粗酶液分底物反应,测粗酶液最适合反应温度(酶活力最高者为100%).

(3)酶的pH稳定性:将酶液分别用 pH为3、4、5、6、7 和 8 的缓冲液进行稀释,放水浴锅中保温(50℃)4 h,按1.3.4.2方法测定剩余酶活力(酶活力最高者为100%).

(4)木聚糖酶的热稳定性:酶活力最高者为100%计,实验分别在 30、40、50、60、70 和 80 ℃条件下将粗酶液放水浴锅中保温1 h,按1.3.4.2方法测定测粗酶液剩余酶活力.

2 结果与讨论

2.1 固体发酵单因素试验

2.1.1 不同配比的碳源对酶活力的影响

由图1可知,单一碳源(即啤酒糟作为碳源时)酶活力比较低,酶活力最高的是混合碳源即啤酒糟、玉米芯与麸皮3者混合物,啤酒糟和玉米芯混合物次之.

图1 碳源不同对产酶的影响

2.1.2 氮源对木聚糖酶活力的影响

由图2可以看出,产木聚糖酶的活力最高的是酵母膏,为促进菌株的产酶加入定量的酵母膏作为氮源是有益的.

图2 氮源不同对酶的影响

2.1.3 不同pH对产木聚糖酶的影响

由图3可知,产木聚糖酶最高的菌株是pH为5时,偏酸或偏碱都不利于酶活力的提高.由此可以看出菌丝细胞内酸碱平衡、分解培养料的营养物质时pH起到一定的调节作用.

图3 不同pH对产木聚糖酶的影响

2.1.4 不同装料量对产木聚糖酶的影响

测定不同装料量发酵产物的酶活力,结果见图4.

由图4可知,装瓶量为5 g时菌株产酶量最高.装料量过多或者过少都影响产酶量.

2.1.5 料水比对产木聚糖酶活力的影响

由图5可看出,料水比为1∶3.2时酶活力最高.料水比不同产酶量而不同,菌体的生长、酶活力会因培养基水分太少而受限制;供氧和散热条件会因水分过大而恶化,酶活力不高,菌体生长缓慢.因此,木聚糖酶合成的关键因素是培养基的含水量.

图5 料水比不同对产酶的影响

2.1.6 培养天数不同对产木聚糖酶的影响

在基础培养基移入定量的菌种,酶活力从第7 d开始测,一天测一次,结果见图6,培养天数不同酶活力不同,酶活力最高峰出现在第8 d,8 d以后,酶活力与天数成反比,这可能是由于长时间发酵产生了其他代谢产物,从而抑制了酶的活性.因此,培养天数以8 d最佳.

图6 培养天数不同对产酶的影响

2.2 产酶条件的正交优化

产酶条件的正交实验结果见表2.

结果表明:16个处理中,产酶量存在一定的差异.影响产酶量因子依次是E﹥D﹥B﹥C﹥A.产酶条件的最优组合为A2B3C2D1E3,即培养基中碳源为啤酒糟∶玉米芯∶麸皮 =6∶2∶2,氮源为1.5%酵母膏,料水比为:1∶3.2,最佳培养时间为8 d,在此培养条件下得到的酶活力最高.

表2 正交试验结果

2.3 木聚糖酶部分酶学性质研究

2.3.1 酶的最适pH

按1.3.5.1方法进行实验,结果见图7.

图7 pH不同对酶活力的影响

由图7可知,该酶的最适反应pH为5,偏酸或偏碱的条件下,木聚糖的酶活力明显下降.

2.3.2 酶的最适温度

按1.3.5.2方法进行实验,结果见图8.

图8 温度不同对酶活力的影响

由图8可知,木聚糖酶活力在50℃ 达到最高值,50℃之前随着温度的升高而增加,速度比较快,60℃后酶活力开始下降,下降速度很快.因此,木聚糖酶的最适反应温度为50℃ .

2.3.3 酶的pH稳定性

按照1.3.5.3方法进行实验,结果见图9.

由图9可知,木聚糖酶在pH为5时酶的相对酶活力达到最高值,几乎为100%,在pH为4~6范围内酶活性较为稳定,而且在pH为4~8范围内酶活力仍保留在50%以上,表明该酶系中可能有多种组分存在,因此该酶具有一定的耐酸和耐碱能力.

图9 酶pH稳定性

2.3.4 酶的热稳定性

按照1.3.5.4方法进行实验,结果见图10.

图10 酶的热稳定性

由图10可知木聚糖酶在40℃时酶的相对活力是100%,而且在30~60℃的范围内,相对酶活力仍保持在80%以上,说明该酶具有广泛的热稳定性.

3 讨论

由正交试验设计可以看出,对木聚糖酶活力的影响因素依次为培养时间、料水比、氮源、pH和碳源,培养基.初始 pH对木聚糖酶的合成有较大影响,但在正交实验中,pH并不是主要的影响因素,因此,在生产中为控制培养基中的 pH变化可以在固体培养基中加入一些缓冲剂.

4 结论

香菇紫金I号以啤酒糟为主要原料产木聚糖酶的优化碳源为:啤酒糟∶玉米芯∶麸皮 =6∶2∶2,氮源为1.5%的酵母膏,pH为5,装瓶量5 g/125 mL三角瓶装,接种量25%,培养天数8 d,料水比1∶3.2.

通过实验得出相关酶学性质,50℃是酶的最佳反应温度,最适pH为5,在pH为4~8范围内酶活力仍保留在50%以上,酶的相对活力是100%的温度为40℃,相对酶活在30~60℃仍保持在80%以上.

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[4] 费笛波,冯观泉,袁超.饲用木聚糖酶活性测定方法的研究[J].浙江农业学报,2004,16(2):53-58.

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