口服盐酸法舒地尔治疗小鼠EAE有效性初探*

张 辉， 张海飞， 李艳花， 刘春云， 尉杰忠， 丁智斌， 杨兴旺，， 杨琬芳， 李俊莲， 冯前进， 丰 玲， 肖保国，4， 马存根， △

(1山西医科大学第一临床医学院神经内科，山西 太原 030001； 2山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民医院神经科，山西 大同 037009； 4复旦大学华山医院神经病学研究所，上海 200025；5山西中医学院第三中医院脑病科，卫生部国家临床重点专科，山西 太原 030024)

口服盐酸法舒地尔治疗小鼠EAE有效性初探*

张 辉1,2， 张海飞2，3， 李艳花2， 刘春云2， 尉杰忠2， 丁智斌1,2， 杨兴旺2，5， 杨琬芳5， 李俊莲5， 冯前进5， 丰 玲2， 肖保国2，4， 马存根1,2，5 △

(1山西医科大学第一临床医学院神经内科，山西 太原 030001；2山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民医院神经科，山西 大同 037009；4复旦大学华山医院神经病学研究所，上海 200025；5山西中医学院第三中医院脑病科，卫生部国家临床重点专科，山西 太原 030024)

目的探讨盐酸法舒地尔口服对实验性自身免疫性脊髓炎(EAE)的治疗效果及机制。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白33-35肽(MOG35-55)免疫雌性C57BL/6小鼠建立慢性EAE模型，随机分为EAE模型组和法舒地尔治疗组。免疫后第3天，对照组予以灌胃生理盐水，治疗组予以法舒地尔，每天1次至免疫后第27天。比较2组小鼠体重变化和临床评分。第28天处死动物，脊髓冰冻切片进行髓鞘染色和HE染色，流式细胞术检测脾细胞M1型和M2型巨噬细胞的表型， ELISA法检测脾细胞培养上清液白细胞介素 10(IL-10)、白细胞介素 1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放。结果法舒地尔口服推迟EAE发病时间，减缓EAE症状，减少体重下降，减少EAE髓鞘脱失和中枢神经系统炎症浸润，抑制M1型巨噬细胞CD16/32表达，增加M2型巨噬细胞CD206和IL-10表达，同时抑制炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的释放。结论法舒地尔口服具有良好的治疗效果，可明显减轻中枢神经系统的髓鞘脱失和炎症病灶。其作用机制可能使M1型巨噬细胞向M2型转化，从而抑制炎症细胞因子释放。

法舒地尔； 口服； 实验性自身免疫性脊髓炎； 巨噬细胞； 细胞因子类

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统炎症脱髓鞘性自身免疫性疾病，其病理特征是T细胞介导的自身免疫而引起髓鞘脱失和轴突损害，具有高致残率和高复发率等特点。MS的治疗主要采用皮下或肌内注射类固醇药物和干扰素β(interferon β, IFN-β)等方法，但给药途径繁琐、副作用大、患者依从性差和费用昂贵等缺点。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)与MS在临床和病理机制等方面有很多相同和相似之处[1]，是研究MS的理想动物模型。Rho/Rho相关激酶(Rho-associa-ted kinase, ROCK)信号通路是机体内普遍存在的一种信号通路，主要参与血管收缩、炎症反应、细胞凋亡等生命活动。近年的研究发现在神经系统退行性疾病如MS和帕金森病(Parkinson disease, PD)等病理过程中，ROCK的异常激活发挥着重要作用。盐酸法舒地尔(fasudil)是临床和科研上常用的ROCK抑制剂，我们前期的研究证实腹腔注射具有良好的治疗EAE的作用[2]。但是MS作为一个复发缓解的慢性疾病，长期采用静脉给药显然存在很大的局限性。因此，本研究目的是探讨法舒地尔口服途径治疗EAE的有效性，并探讨其作用机制，为今后临床使用法舒地尔口服治疗MS等神经炎症或变形疾病提供实验依据。

材 料 和 方 法

1动物和材料

雌性C57BL/6小鼠14只，8～10周龄，体重18～20 g，购自北京维通利华公司。小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide, MOG35-55)由西安联美生物科技有限公司合成；完全福氏佐剂购自Sigma；结核分枝杆菌(tuberculosis bacilli,TB)H37Ra购自BD；百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)购自ENZO；白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-10和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)测定ELISA试剂盒购自Peprotech。流式细胞仪为BD FACS Calibur产品。流式抗体购自Becton Dickinson。

2主要方法

2.1EAE模型制备及法舒地尔处理

2.1.1EAE模型制备 C57BL/6雌性小鼠实验前在无病源菌实验室饲养1周后，按平均体重随机分为EAE对照组(n=7)和法舒地尔治疗组(n=7)。将3.5 mg MOG35-55溶解于0.7 mL生理盐水，4.2 mg TB溶解于0.7 mL完全福氏佐剂，两者混合，用针管混合器推成油包水样乳剂，乳剂静置后无扩散即为合格。小鼠用乙醚麻醉后，于小鼠脊柱两侧分4点皮下注射，每只0.1 mL。于免疫当天和48 h后，腹腔分别注射PTX(每只0.75 mg)以加强动物免疫反应。

2.1.2法舒地尔处理 鼠免疫后第3天开始灌胃(生理盐水每天每只200 μL， 法舒地尔每天每只1 mg/200 μL)，持续给药至免疫后27 d。自免疫当天开始每天观察小鼠临床评分并记录其体重变化。临床评分标准采取国际通用的5分法：0分，无任何临床症状；1分,尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分，一侧后下肢无力，被动翻身可以恢复；3分，双后肢瘫痪，被动翻身不能恢复，但予以刺激可以挪动；4分，双后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡。评分介于两者之间者以±0.5分计。累积临床评分[3]为自小鼠发病当天起(疾病评分≥1)至实验结束评分的总和。累积疾病指数[4]计算方法为累积疾病指数为组内每只小鼠每天临床评分总和的均数。

2.2标本采集 于免疫后28 d，采用0.3%戊巴比妥钠麻醉后取脾脏，制备成单个核细胞悬液。同时，动物用生理盐水灌注，再用4%多聚甲醛行组织固定，分离脊髓，OCT(optimal cutting temperature)包埋剂包埋，于液氮中冷冻，做冰冻切片，厚度为10 μm， 行髓鞘染色和HE染色。

2.3HE染色 将切片水中浸泡2 min,苏木精染色4 min,快速水洗，0.5%盐酸乙醇分化15 s，0.5%伊红30 s, 快速水洗,梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察。

2.4髓鞘染色 取切片于70%乙醇中浸泡15 min，浸于固蓝液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去离子水浸洗5 min，0.05%碳酸锂快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰质与白质能够清晰辨别，去离子水浸洗5 min，梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察。

2.5流式细胞术检测 小鼠脾细胞悬于50 μL 0.1%皂苷(saponin)/1%BSA-PBS破膜剂或1%BSA-PBS缓冲液中，分别加1 μL流式抗体，包括Flour-488-CD11b、PE-IL-10、PE-CD16/32和PE-CD206抗体，室温避光20 min。PBS洗2次，各加500 μL PBS，上流式细胞仪检测。

2.6ELISA法检测IL-1β、IL-10和TNF-α 小鼠脾细胞培养48 h后，收集上清液置-80 ℃待检测。IL-1β、IL-10和TNF-α的浓度采用商业ELISA试剂盒，具体检测方法参照试剂盒说明书。参考各因子的标准曲线计算其含量，结果以ng/L表示。

3统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)，采用GraphPad Prism 5.0软件分析，组间比较采用t检验或Mann-WhitneyU检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1法舒地尔口服对EAE小鼠的疗效比较

EAE小鼠于免疫后第10天到第14天陆续发病，表现为精神萎靡、食欲减少、皮毛不光滑和体重减轻等，直至发生肢体瘫痪，最高分达4.5分，平均发病天数为免疫后第(12.75±2.25)天，而法舒地尔治疗组平均发病天数为免疫后第(15.57±2.82)天，与EAE对照组平均发病天数相比明显推迟，差异有统计学意义(P<0.05)。EAE对照组平均高峰期评分为2.75±1.00，而法舒地尔治疗组为1.43±0.45，与EAE对照组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。EAE对照组累积临床评分为28.63±11.09，而法舒地尔治疗组累积临床评分为12.71±4.92，较EAE对照组明显降低，有统计学意义(P<0.01)。EAE对照组累积疾病指数为1.56±0.56，而法舒地尔治疗组累积疾病指数为0.71±0.24，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1A。EAE对照组临床症状的加重可伴体重减轻，法舒地尔治疗小鼠可明显减缓体重的减轻(P<0.05或P<0.01)，见图1B。

Figure 1. The incidence of the mice in EAE group and fasudil intervention group. A: clinical score; B: body weight. The comparison in each time point was separately analyzed by Mann-WhitneyUtest.Mean±SD.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

图1EAE组和法舒地尔组发病情况

2法舒地尔口服减少EAE中枢炎症细胞浸润和髓鞘的脱失

HE染色显示，与法舒地尔治疗组相比，EAE对照组白质出现大量炎症细胞浸润，其中腰膨大部位明显，炎症浸润细胞计数为368.00±57.07，而法舒地尔治疗组为75.67±9.29，有统计学意义(P<0.05)，见图2。髓鞘染色显示EAE对照组出现大量髓鞘脱失，而法舒地尔治疗组髓鞘脱失被有效抑制。EAE对照组髓鞘脱失与白质面积比值为(25.6±8.6)%，法舒地尔组为(4.1±1.3)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3法舒地尔对脾巨噬细胞的影响

流式细胞术检测M1型巨噬细胞的标志CD16/32和M2型巨噬细胞的标志CD206和IL-10,结果发现，法舒地尔治疗并不能明显影响M1型细胞CD16/32的表达，但可以明显增加M2型细胞CD206和IL-10的表达，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。计算M1型表面标志CD16/32和CD206表达的比值，发现法舒地尔组表达比值明显低于EAE对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。上述结果提示法舒地尔口服治疗可以诱导炎症M1型巨噬细胞向抗炎的M2型转化。

Figure 2. The Luxol fast blue myelin staining and HE staining of mouse spinal cord in EAE group and fasudil intervention group.Mean±SD.n=7.*P<0.05vsEAE group.

图2EAE组和法舒地尔组小鼠脊髓HE染色和髓鞘染色及统计

Figure 3. The effect of fasudil on the phenotype of splenic macrophages. Cells were stained with macrophage marker CD11b and M1/M2 markers, and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

图3法舒地尔对脾巨噬细胞表型的影响

4法舒地尔对细胞因子的影响

采用ELISA法对培养48 h后脾细胞上清液IL-1β、IL-10和TNF-α进行检测。法舒地尔治疗组脾细胞培养上清液中IL-1β和TNF-α浓度明显低于EAE对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而IL-10的浓度则增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。这一结果表明，法舒地尔治疗可有效抑制EAE小鼠外周免疫性炎症反应。

Figure 4. Fasudil inhibited the production of inflammatory cytokines.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group.

图4法舒地尔抑制炎症因子的释放

讨 论

鉴于MS的病因及发病机制的复杂性[5]，目前针对MS尚缺乏有效的治疗。MS的治疗多采取静脉滴注或皮下、肌内注射类固醇药物、免疫修饰药物如醋酸格拉默和IFN-β，免疫调节药物如免疫球蛋白等。这类药物虽对MS的病程有所缓解，但其价格昂贵，远期使用副作用大，如醋酸格拉默易引起肝功能异常、流感样病变，IFN-β易引起局部皮肤红肿及全身反应明显[6]。而且静脉、皮下注射给药途径长期使用对患者造成不便和痛苦，并导致患者的依从性差。虽然目前已有MS的口服药物，但价格非常昂贵，病人使用受到很大局限。因此，探讨新的安全可靠、简捷有效的口服治疗MS药物具有重要的临床实际意义。

法舒地尔作为一种选择性Rho激酶抑制剂，临床上主要治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛。由于其副作用小、作用靶点多，在神经退行性疾病中可能表现良好的治疗潜能。Sun等[7]研究发现通过腹腔注射法舒地尔可减少EAE小鼠中枢神经系统的炎症细胞浸润和外周特异性淋巴细胞的数目。Feske等[8]指出，法舒地尔可以促进EAE小鼠神经轴突再生，减低血管通透性，抑制炎症细胞聚集和炎症因子的释放。我们前期研究发现，法舒地尔腹腔注射可明显改善EAE小鼠临床症状，并可下调NF-κB[9]和抑制occludin的表达[10]，减少炎症浸润和髓鞘脱失。但是，法舒地尔的静脉剂型不适合MS病人的长期使用，本实验通过法舒地尔的口服途径，研究其对EAE的治疗效果。结果显示法舒地尔口服可延迟EAE的发病，缓解EAE的症状，降低脊髓的炎症反应和髓鞘脱失。目前关于探讨法舒地尔给药途径的实验研究大多是腹腔注射，而法舒地尔口服给予治疗EAE的研究尚无文献报道。考虑到MS是一个需要长期治疗的疾病，因此口服治疗尤其显得重要和必要。口服途径作为临床上最常用的给药方式，与临床静脉给药相比，具有安全、简便、患者依从性好等优点。尽管口服治疗有效，但其效果似乎不如腹腔给予，我们仍将进一步研究试图提高其治疗的效果，为今后临床法舒地尔口服治疗MS提供了可行性。

已有研究表明，巨噬细胞在EAE的发生发展中具有关键作用[11]。现有研究证实巨噬细胞可分为M1和M2型，M1型由Th1细胞分泌的致炎症因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α诱导激活，高表达IL-1β、TNF-α等促炎因子，促进免疫炎症反应。而M2型可由Th2细胞分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β1等选择性激活，可高表达IL-10和TGF-β1抑制炎症。正常情况下，这两类细胞通过分泌细胞因子相互制约以致动态平衡，达到免疫稳态的效果。目前的研究提示EAE的发病机制与M1和M2之间细胞因子分泌失衡有关[12]。细胞因子微环境决定巨噬细胞M1和M2的极化。已有体外实验证实，法舒地尔可直接促进炎症MI巨噬细胞向M2转化[13]。本实验结果显示，法舒地尔口服治疗虽不能影响M1型表面标志CD16/32的表达，但可以明显增加M2型表面标志CD206和细胞因子IL-10表达，其平衡明显偏向M2表型，即表现为M1与M2巨噬细胞比值降低。这些结果提示法舒地尔口服治疗可诱导炎症M1巨噬细胞向抗炎M2型细胞分化。这一结果很可能与我们观察到的法舒地尔口服治疗减低炎症细胞因子分泌密切相关。

综上所述，法舒地尔口服治疗可以有效改善EAE的临床症状，抑制炎症病灶并改善髓鞘脱失，其作用机制可能与调节巨噬细胞的极性，抑制系统免疫炎症反应有关。进一步的深入研究仍然必要，以便为今后临床使用法舒地尔口服治疗提供新的思路和奠定实验依据。

[1] 李 勇,郑荣远,李剑敏,等. 实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠模型的复制[J]. 中国病理生理杂志,2005,21(2):414-416.

[2] Liu CY, Li YH, Yu JZ, et al. Targeting the shift from M1 to M2 macrophages in experimental autoimmune encephalomyelitis mice treated with fasudil[J]. PLoS One, 2013，8(2):e54841.

[3] Fagone P, Mangano K, Quattrocchi C, et al. Prevention of clinical and histological signs of proteolipid protein (PLP)-induced experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice by the water-soluble carbon monoxide-releasing molecule (CORM)-A1[J]. Clin Exp Immunol, 2011，163(3): 368-374.

[4] Kafami L, Raza M, Razavi A, et al. Intermittent feeding attenuates clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2010,2(1):47-52.

[5] 谢富华,熊旭明,梁 兵,等. 雷公藤多苷联合地塞米松对EAE中TLRs/NF-κB信号通路的作用[J]. 中国病理生理杂志,2012,28(11):1961-1965.

[6] Goodin D. Comparative studies of glatiramer acetate and interferon beta[J]. Int MS J, 2008， 15(2): 39-41.

[7] Sun X, Minohara M, Kikuchi H, et al . The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune cephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol， 2006，180(1-2):126-134.

[8] Feske SK, Sorond FA, Henderson GV, et al . Increased leukocyte ROCK activity in patients after acute ischemic stroke[J]. Brain Res， 2009，1257:89-93.

[9] 侯绍蔚,刘岳婷,郭敏芳,等. 盐酸法舒地尔治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的潜能与抗炎作用[J]. 中国临床神经科学, 2012，20(2): 126-134.

[10] 刘岳婷, 侯绍蔚, 刘春云,等 法舒地尔通过诱导EAE小鼠Occludin表达抑制其炎性细胞浸润[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 2012，19(3): 206-210.

[11] Mensah-Brown EP, Shahin A, Al Shamisi M, et al. Early influx of macrophages determines susceptibility to experimental allergic encephalomyelitis in Dark Agouti (DA) rats[J]. J Neuroimmunol, 2011，232 (1-2): 68-74.

[12] Filion LG, Graziani-Bowering G, Matusevicius D, et al. Monocyte-derived cytokines in multiple sclerosis[J]. Clin Exp Immunol, 2003，131(2): 324-334.

[13] 张海飞, 郭敏芳, 孟 健,等. 法舒地尔对LPS刺激小胶质细胞表型演变的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2012，28(8): 818-821.

Oraladministrationoffasudilhydrochloridesuppressesdevelopmentofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHANG Hui1,2, ZHANG Hai-fei2,3, LI Yan-hua2, LIU Chun-yun2, YU Jie-zhong2, DING Zhi-bin1,2, YANG Xing-wang2,5, YANG Wan-fang5, LI Jun-lian5, FENG Qian-jin5, FENG Ling2, XIAO Bao-guo2,4, MA Cun-gen1,2,5

(1DepartmentofNeurology,theFirstClinicalMedicalCollege,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China;3DepartmentofNeurology,theFifthPeople’sHospitalofDatongCity,Datong037009,China;4InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China;5DepartmentofEncephalopathy,NationalMajorClinicalDepartmentofMinistryofHealth,theThirdHospital,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of fasudil hydrochloride by the oral route on the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice and its possible mechanism.METHODSThe EAE model in female C57BL/6 mice was established by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide(MOG35-55) immunization and the immunized mice were randomly divided into saline control group and fasudil intervention group, in which saline and fasudil were administered by the oral route once every day from post-immunization (PI) day 3 to day 27. Clinical score and body weight were recorded every other day. On PI day 28, the spinal cords were obtained for HE and myelin staining. The splenocytes were isolated and the expression of CD16/32, CD206 and interleukin (IL)-10 was analyzed by flow cytometry. The levels of IL-1β and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA.RESULTSOral administration of fasudil delayed the onset of EAE, and attenuated the myelinoclasis of the model animals and the severity of EAE, accompanied by the phenotypic switch from M1 to M2 macrophages, the inhibition of the proinflammatory cytokine (IL-1β and TNF-α) production and the increase in IL-10 release.CONCLUSIONOral administration of fasudil exhibits therapeutic effect on the development of EAE possibly through switching M1 macrophages to M2 phenotype and inhibiting inflammatory responses in mice.

Fasudil; Oral administration; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Macrophages; Cytokines

R320.54

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.026

1000- 4718(2013)11- 2060- 06

2013- 07- 22

2013- 09- 22

国家自然科学基金资助项目(No.81070957; No.81272163);山西中医学院“2011计划”培育计划资助项目(No.2011PY-1);2013年度国家国际科技合作专项项目(No.2013DFA30700);山西省青年自然科学基金资助项目(No.2012021034-2);山西大同大学青年科学研究项目(No.2010Q6)

△通讯作者Tel: 0351-2272208; E-mail: macungen2001@163.com