IFN-γ上调人胃癌细胞株PD-L1表达*

陈淑芬， 侯婧瑛， 吴淑云， 王凌云△

(中山大学孙逸仙纪念医院 1消化内科， 2急诊科，广东 广州 510120)

IFN-γ上调人胃癌细胞株PD-L1表达*

陈淑芬1， 侯婧瑛2， 吴淑云1， 王凌云1△

(中山大学孙逸仙纪念医院1消化内科，2急诊科，广东 广州 510120)

目的研究不同人胃癌细胞株表面程序性死亡配体1(PD-L1)表达及干扰素γ(IFN-γ)对其表达的诱导情况。方法分别培养不同人胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901，经不同浓度IFN-γ、作用不同时间后，利用流式细胞术及real-time PCR检测胃癌细胞株PD-L1在蛋白和mRNA水平的表达情况。结果流式细胞术显示AGS、BGC823、MGC803和SGC7901细胞PD-L1蛋白表达率分别为(1.567±0.109)%、(2.640±0.577)%、(1.760±0.236)%和(16.030±1.289)%；不同胃癌细胞株对IFN-γ反应不同，经不同浓度IFN-γ刺激后均可不同程度上调PD-L1的表达(P<0.05)；real-time PCR显示10 μg/L IFN-γ刺激各胃癌细胞株12 h后PD-L1 mRNA水平上调(P<0.05)。结论胃癌细胞株组成性表达PD-L1；IFN-γ可上调胃癌细胞株PD-L1的表达，呈现浓度、时间依赖性；其中以SGC7901细胞(来源于转移淋巴结)表达最高，推测胃癌细胞中PD-L1的表达与肿瘤分化程度无关，与组织来源和淋巴结转移有关；IFN-γ上调胃癌细胞PD-L1，表明IFN-γ并非都是抑制肿瘤增殖、生长，可能参与介导肿瘤免疫逃逸，故临床运用IFN-γ辅助治疗胃癌时应慎用。

胃癌细胞； 程序性死亡配体1； 干扰素γ； 预后

程序性死亡配体1(programmed death ligand 1, 简称PD-L1，又称为B7-H1)，是一种含有290个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，于1997年被Dong等[1]从胎盘cDNA文库中发现并确认。PD-L1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞、活化T/B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。在许多肿瘤组织亦有PD-L1蛋白的表达，如宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[2-3]，且肿瘤组织中PD-L1的表达水平较癌旁组织明显升高,与患者临床预后紧密相关[1,4]。胃癌是常见且恶性程度较高的消化道恶性肿瘤，手术是首选治疗方法，然而术后患者预后差，5年总生存率仅约30%～50%，术后联合免疫治疗和/或化疗方案有着较为肯定的疗效。干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)因其具有抑制肿瘤细胞增殖、调节免疫功能的作用而广泛用于肿瘤治疗。近年研究发现IFN-γ可诱导乳腺癌细胞、胰腺癌PD-L1表达[2,5]。目前国内外关于胃癌细胞株PD-L1表达及IFN-γ对其表达影响的研究及报道较少。本研究通过流式细胞术及实时荧光定量RT-PCR分析不同胃癌细胞株PD-L1表达，并探讨IFN-γ能否上调不同胃癌细胞株PD-L1表达，以期为胃癌的综合治疗方案提供依据。

材 料 和 方 法

1材料

胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均由中山大学孙逸仙纪念医院黄开红教授惠赠；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培养基均购于HyClone；IFN-γ购于Peprotech；PE标记抗人PD-L1抗体和PE标记小鼠IgG1同型抗体均购于eBioscience。Trizol和TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 均购于宝生生物公司，SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix购于华南地区Bio-Rad总代理；FACS流式细胞仪为BD产品。CFX96实时荧光定量PCR仪为Bio-Rad产品。

2方法

2.1不同浓度IFN-γ对胃癌细胞PD-L1表达的影响 待体外培养的胃癌细胞处于生长对数期时，消化制成细胞悬液，调整密度为1×108/L，接种于24孔板培养24 h，分别加入不同浓度IFN-γ(0 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L和80 μg/L)，继续培养24 h收获细胞。每次设置3个复孔，重复3次。

2.2IFN-γ刺激不同胃癌细胞株不同时点PD-L1表达 取对数生长期胃癌细胞，接种于24孔板，实验组加10 μg/L[5-6]IFN-γ，分别培养不同时间(0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h)，每个时点设置3个复孔，收获各时段细胞。重复3次。

2.3流式细胞术检测 收集上述处理细胞，0.02%EDTA消化，离心，1 000 r/min 5 min，PBS(含1%FBS)洗涤2次；PBS(含1%FBS)重悬细胞，调整细胞密度为1×109/L；各吸取100 μL细胞悬液，分为2管，分别加入PE标记小鼠IgG1和PE标记鼠抗人 PD-L1抗体1 μL，混匀置于4 ℃避光孵育30 min，2 mL PBS洗涤1次，300 μL PBS重悬，上机检测。

2.4Real-time PCR 细胞悬液接种于6孔板，10 μg/L IFN-γ干预12 h，据TaKaRa Total RNA说明书提取总RNA，-80℃保存；按TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 说明书合成cDNA， -20℃保存；引物设计合成由Life Invitrogen 公司完成。β-actin正义序列5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，反义序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；PD-L1正义序列 5’-GGACAAGCAGTGACCATCAAG-3’，反义序列5’-CCCAGAATTACCAAGTGAGTCCT-3’。按照Bio-Rad SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix说明书实验。体系为20 μL，取2 μL cDNA产物分别与PD-L1引物和β-actin引物进行反应，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重复40次循环。Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪操作反应。数据分析采用2-ΔCt。

3统计学处理

采用SPSS 16.0软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。两组样本均数比较采用t检验；多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间多重比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均表达PD-L1

流式细胞术结果显示不同胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均不同程度表达PD-L1(与标记同型抗体的胃癌细胞株相互比较，差异有统计学意义，均P<0.05)；其中以SGC7901表达最高[(16.030±1.289)%]，余依次为BGC823、MGC803和AGS,见图1。

2胃癌细胞经IFN-γ刺激后呈现剂量和时间依赖性上调PD-L1蛋白表达

流式细胞术结果证实胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均可经不同浓度IFN-γ刺激后上调PD-L1，并呈现剂量依赖性：随着IFN-γ浓度升高，PD-L1蛋白表达呈现增高趋势，差异有统计学意义(P<0.05),见图2；在10 μg/L IFN-γ刺激不同时间后，不同胃癌细胞株PD-L1蛋白表达均呈现上升趋势，48 h达高峰，72 h后开始下降，其中BGC823、MGC803和SGC7901表达与0 h比较，差异有统计学意义，见图3。不同胃癌细胞株对IFN-γ的反应敏感性不同，以BGC823和SGC7901较为敏感，低浓度(5 μg/L和10 μg/L)IFN-γ即可上调PD-L1表达(P<0.05)，而细胞株AGS和MGC803则需要中浓度(40 μg/L)和高浓度(80 μg/L)IFN-γ上调PD-L1表达(P<0.05)，见图2。

Figure 1. PD-L1 surface expression in four different human gastric cancer cell lines analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsisotype control.

图1不同胃癌细胞株表面PD-L1的表达

Figure 2. Dose-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. AGS,BGC823, MGC803 and SGC7901 cells were treated with diffenrent concentrations of IFN-γ for 24 h. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L.

图2不同浓度IFN-γ对不同胃癌细胞株PD-L1表达的影响

Figure 3. Time-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. Human gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L) for diffenrent time. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

图3IFN-γ作用不同时间对不同胃癌细胞株PD-L1表达的影响

3IFN-γ上调胃癌细胞株PD-L1mRNA表达

Real-time PCR结果显示10 μg/L IFN-γ刺激胃癌细胞12 h，各种胃癌细胞PD-L1 mRNA水平均上调，差异有统计学意义(P<0.05)，其中以SGC7901细胞最明显，见图4。

讨 论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，根治性手术是治疗的首选方法，但术后复发率高，预后差。据调查，我国胃癌的发病率及死亡率均高于世界水平[7]。提高生存率，改善患者预后具有重要意义。研究发现PD-L1表达阳性的胃癌患者其1年、3年生存率均低于表达阴性者，术后PD-L1可明显下降，而复发时升高[3]。高表达PD-L1的肿瘤患者术后复发率明显升高，无病生存率及总生存率均明显低于PD-L1阴性或低表达者[4]。故目前PD-L1已被公认可作为评估肿瘤患者预后的独立因素[4,8-9]。我们前期通过免疫组化发现胃癌组织表达PD-L1，PD-L1表达阳性者与表达阴性组的1年生存率上未见明显差异，而3年生存率存在差异性，表达阳性组较阴性组3年生存率相对较低，差异有统计学意义(未发表)。本研究通过流式细胞术及RT-PCR技术分别从蛋白及mRNA水平检测各胃癌细胞株中PD-L1表达情况。实验发现胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均组成性表达PD-L1。实验选用不同分化程度、不同来源的胃癌细胞系(AGS和BGC823均为低分化胃腺癌，MGC803为低分化胃黏液腺癌，SGC7901为中分化胃癌淋巴结转移灶)，以SGC7901细胞表面PD-L1表达最高，考虑可能与其来源于胃癌转移淋巴结，而PD-L1高表达于活化淋巴细胞有关。实验结果提示PD-L1的表达水平与肿瘤的分化程度无直接关系，而可能与胃癌细胞组织来源及淋巴结转移相关。

Figure 4. PD-L1 relative mRNA expression stimulated with IFN-γ in four different gastric cancer cell lines. The gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L)for 12 h. The relative expression of PD-L1 mRNA was analysed by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4IFN-γ刺激不同胃癌细胞株前后PD-L1mRNA相对表达量

在胃癌进展过程中，IFN-γ逐渐减少，甚至难以检测[10],因此我们推测IFN-γ下降与胃癌分期有关。焦付丰等[11]亦发现胃癌患者IFN-γ较正常对照组分泌减少；刘晓玲等[12]研究证实胃癌化疗后部分缓解的患者IFN-γ较化疗前升高。体内外实验均证明IFN-γ能抑制肿瘤生长及肿瘤的复发、转移，并在机体免疫调节中发挥着重要作用，故IFN-γ被广泛用于临床抗肿瘤治疗。本实验首先运用流式细胞术发现持续IFN-γ刺激可上调胃癌细胞株PD-L1蛋白的表达；且不同胃癌细胞对上调PD-L1蛋白所需IFN-γ刺激浓度、时间不一，考虑可能与细胞对IFN-γ敏感程度差异有关[13]；为了进一步探讨IFN-γ在mRNA水平对PD-L1诱导情况，我们选用文献中常用的IFN-γ浓度(10 μg/L)刺激胃癌细胞，利用real-time PCR检测发现IFN-γ刺激胃癌细胞后，PD-L1 mRNA表达升高，差异有统计学意义。目前导致IFN-γ上调PD-L1表达的机制尚不明确，有学者发现在PD-L1启动子区域含有数个IFN-γ反应元件[6，14]，我们从mRNA及蛋白水平均发现经IFN-γ处理后胃癌细胞PD-L1表达升高，故推测IFN-γ可能在PD-L1基因转录调控水平发挥作用，从而上调其在肿瘤细胞表面的表达。但PD-L1具体调节机制仍需进一步探索。

本实验证明IFN-γ可上调胃癌细胞PD-L1表达, 而肿瘤细胞高表达PD-L1，能降低其自身免疫原性，促使肿瘤细胞逃避机体的免疫系统攻击[14]，表明IFN-γ并非都是抑制肿瘤增殖、生长，可能一定程度上促进肿瘤免疫逃逸[5]，所以临床上运用IFN-γ治疗肿瘤时应谨慎。

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Interferon-γup-regulatesprogrammeddeathligand1inhumangastriccancercells

CHEN Shu-fen1, HOU Jing-ying2, WU Shu-yun1, WANG Ling-yun1

(1DepartmentofGastroenterology,2EmergencyDepartment,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xzr020@aliyun.com)

AIM: To study the expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) in human gastric cancer cells with or without the stimulation of interferon-γ (IFN-γ).METHODSThe protein levels of PD-L1 in 4 different human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 with or without IFN-γ treatment were analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of PD-L1 in those cell lines was also detected by real-time PCR.RESULTSFlow cytometry analysis showed that the rates of PD-L1 surface expression in the 4 human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 were (1.567±0.109)%, (2.640±0.577)%, (1.760±0.236)% and (16.030±1.289)%, respectively. After the 4 gastric cancer cell lines were treated with IFN-γ at different concentrations or for different time, the PD-L1 surface expression increased at different levels with significant differences between groups. Real-time PCR also indicated that IFN-γ up-regulated PD-L1 expression at mRNA level.CONCLUSIONPD-L1 surface expression is found in human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901. IFN-γ up-regulates the expression of PD-L1. SGC7901 cell line, which is from metastatic lymph nodes, expresses the highest protein level of PD-L1 among the 4 cell lines, indicating that PD-L1 expression may be related to lymph node metastasis, not to differentiation grade. IFN-γ may mediate the tumor immune escape so that it should be carefully applied in the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer cells; Programmed death ligand 1; Interferon-γ; Prognosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.006

1000- 4718(2013)11- 1952- 05

2013- 08- 20

2013- 10- 02

广东省科技社会发展项目(No. 2012B031800362)

△通讯作者 Tel：020-81332489；E-mail:xzr020@aliyun.com