一株芽孢杆菌溶藻活性物质的特性研究

许 波，于 靓，熊儒先，缪礼鸿

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

富营养化是我国目前及今后相当长一段时期内的重大水环境问题，富营养化带来的一个突出问题是蓝藻水华暴发导致水中溶解氧含量下降，水质严重恶化，并产生毒素，严重破坏原有水体的生态环境［1］。在利用物理、化学和其它生物方法治理水华不甚理想的情况下，研究利用溶藻细菌防治水华和赤潮已经引起国内外学者的关注［2］。溶藻细菌(Algae-lysing bacterium)能够通过直接或间接方式，抑制藻类生长或杀死藻类，从而溶解藻细胞［3］。近年来，国内外不断分离和发现新的溶藻细菌［4－5］。已报道的溶藻细菌主要有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌等，它们的作用对象比较广泛，既有蓝藻也有甲藻和硅藻，这些溶藻细菌多数是通过分泌胞外物质到环境中抑制藻的生长，导致藻细胞的溶解，如分泌蛋白质、抗生素、氨基酸［6－8］等。本文报道了一株芽孢杆菌产生的溶藻活性物质的特性及其影响因子。

1 材料和方法

1.1 供试菌株及培养基

铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa，FACHB 905)，由中科院水生生物所藻种保藏中心(FACHB)提供，其无菌铜绿微囊藻905A由本实验室分离纯化获得。藻种培养采用BG11培养基。

供试细菌及培养:T1芽孢杆菌为本实验室分离保存。T1芽孢杆菌培养基:芽孢杆菌的培养采用LB培养基［9］，其中固体培养基的琼脂含量为2%。

1.2 T1芽孢杆菌生长曲线的测定

细菌生长曲线的测定参考［9］。将经过活化的T1芽孢杆菌菌液转接到100 mL LB培养基中，在37℃，170 r/min的条件下培养，每隔4 h取样测定测OD值。

1.3 高温处理对T1滤液溶藻活性的影响

取1 mL T1无菌滤液(5 000 r/min离心，用0.25 μm无菌纤维素酯微孔滤膜过滤)，分别用80℃水浴处理和115℃高压蒸汽灭菌锅处理30 min，按接种量2%分别加入铜绿微囊藻液905A中光照培养，藻细胞初始浓度约为1.0×106个/mL、体积为10 mL，在30 ℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)恒温光照培养箱中培养，空白对照分别为在相同藻液中加入2%的无菌水和LB培养液，每组做2个平行对照，每隔24 h用血球计数板法测得藻数。

1.4 不同培养基对T1芽孢杆菌溶藻活性的影响

分别用牛肉膏和LB培养基37℃活化并培养T1菌株在37℃，170 r/min的条件下，取36 h的发酵液，按2%添加量分别接入两种培养基培养的T1菌液，加入到10 mL初浓度为106个/mL的微囊藻905藻液中，放置在恒温光照培养箱中25℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)的条件下培养，空白对照分别加入2%的培养基到微囊藻905A藻液中，每组做2个平行对照，每隔24 h用血球计数板法测得藻数。

1.5 不同pH条件下T1对铜绿微囊藻905A的溶藻作用

将新鲜培养的微囊藻905A分别接入到无菌的pH=9.0，pH=4.0 及未调 pH(pH=7.0) 的 BG11液体培养基中，测得初始藻浓度为1.0×106个/mL。按2%分别接入无菌水(CK)和已用LB培养基活化待用的T1菌液(菌液初始浓度为1.16×106个/mL)，在30 ℃、2 000 lux、14∶10(光∶暗)的光照培养箱中培养，每组做2个平行对照，每隔24 h用血球计数板法测得藻数，并计算抑藻率。藻细胞数抑藻率(%)=［(对照样藻细胞数－处理样藻细胞数)/对照样藻细胞数］×100%。

1.6 不同浓度蛋白酶K作用下对T1溶藻的影响

将T1芽孢杆菌活化接种到LB液体培养基中，在37℃，170 r/min条件下发酵24 h，经离心及微孔滤膜过滤除菌后获得T1无菌滤液，按2%加量将T1无菌滤液加入到初始藻细胞浓度约为1.0×106个/mL、体积为10 mL铜绿微囊藻液905A中，并将配好的蛋白酶K溶液加入藻液中，使藻液中蛋白酶K浓度分别达到 20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，对照组中1组不加蛋白酶K溶液，另外1组加入2%的LB培养基作为空白对照，每组做2个平行对照，于30℃、2 000 lux，14∶10(光∶暗)恒温光照培养箱中培养，测定藻数变化。

2 结果与讨论

2.1 T1芽孢杆菌生长曲线的测定

从图1可以看出，菌株T1的延缓期很短，培养24 h左右菌液的OD值达到最大值，20—28 h处于稳定期，28h以后菌体进入衰亡期。

图1 T1菌株的生长曲线

2.2 T1芽孢杆菌溶藻活性物质的耐热性测定

结果表明(图2)，经过80℃和115℃高温处理的2个T1无菌滤液样品的溶藻活性与未处理的对照相比没有明显下降，表明T1芽孢杆菌产生的溶藻活性物质具有较好的耐高温性能。

图2 高温处理对T1无菌滤液溶藻活性的影响

2.3 培养基对溶藻活性的影响

如图3所示，牛肉膏培养基和LB培养基本身有微弱的溶藻作用，可能与培养基中存在某些氨基酸等抑藻成分有关。而2种培养基分别接种T1芽孢杆菌培养后的菌液溶藻活性显著增加，表明细菌培养过程中有新的溶藻活性物质产生。采用LB培养基培养的T1菌液在第4 d就将铜绿微囊藻905A完全裂解，比用牛肉膏培养基培养菌液溶藻时间缩短了1 d，表明用LB培养基比牛肉膏培养基培养的T1菌液的溶藻活性更高。

图3 培养基对T1溶藻效果的影响

2.4 水体pH值对溶藻效果的影响

实验结果显示(图4)，T1芽孢杆菌溶藻效果与水体pH值有关。水体pH=9时T1芽孢杆菌的溶藻效果最好，pH=7次之，pH=4最差，添加无菌水和LB培养基的2个对照组微囊藻905A的生长状况相差不大。表明当T1芽孢杆菌在弱碱性环境中的溶藻活性最高，3—4 d时间内抑藻率达到98%以上。

2.5 蛋白酶对T1芽孢杆菌溶藻活性的影响

实验结果表明(图5)，加入不同浓度的蛋白酶K后，T1无菌滤液的溶藻活性并没有受到明显的影响。由此可以推测，T1芽孢杆菌产生的溶藻活性物

图4 水体pH对T1芽孢杆菌溶藻效果的影响质不是蛋白质类。

图5 不同浓度蛋白酶K作用下对T1溶藻差异比较

3 结论

溶藻芽孢杆菌T1在37℃、170 r/min的条件下培养20h活菌数达到最大值。采用LB培养基比用牛肉膏蛋白胨培养基培养T1菌液的溶藻活性更强。经80℃和115℃高温处理的T1无菌滤液的溶藻活性与未经过处理对照无明显差异，表明T1产生的溶藻活性物质具有较好的耐热性。T1的溶藻活性与水体pH有关，碱性条件下T1的溶藻活性比酸性条件下高。T1芽孢杆菌无菌滤液经蛋白酶K处理后其溶藻活性没有明显变化，推测T1能够产生非蛋白质类溶藻活性物质。

［1］张民，史小丽，蒋丽娟，等.两种外源性磷及振荡对铜绿微囊藻生长的影响［J］.应用与环境生物学报，2002，8(5):507 －510.

［2］吴刚，席宇，赵以军.溶藻细菌研究的最新进展［J］.环境科学研究，2002，15(5):43 －46.

［3］李永欣，韩绍印，席宇.水样预处理法分离溶藻细菌效果观察［J］.郑州大学学报(医学版)，2006，41(5):865 －867.

［4］关英红，马军，雷国元，等.一株溶藻菌株的分离鉴定及溶藻特性［J］.环境科学学报，2008，28(7):1288－1293.

［5］Dakhama A，Isolation and identification of antialgalsubstances produced by Pseudomonas aeruginosa［J］.J Appl Phycol，1993，5(9):297－306.

［6］Lee S O，Kato J.Takoguchi N，et al.Involvement of an extracellular protease in Algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66(1):4334－4339.

［7］Imamura N，Motoike I，Shimada N，et al.An efficient screening approach for anti－Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem［J］.Antibiotics，2001，54(7):582－587.

［8］Yoshikawa K，Adachi K，Nishijima M，et al.β－Cyanoala－nine production by marine bacteria on cyanide－free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacter［ J］.Appl Environ Microbiol，2000，66(2):718 －722.

［9］赵斌，何绍红，微生物学实验［M］.北京:科学出版社，2002.