口腔鳞癌Th1／Th2平衡漂移中IL-4、IL-10、TGF-β表达与肿瘤发展关系探讨

申叶春，曹 岩，张 凡

（1.河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市第一医院口腔科，河北 张家口 075000；3.河北北方学院附属第一医院病理科，河北 张家口 075000）

肿瘤细胞与间质浸润淋巴细胞相互作用促使肿瘤细胞和淋巴细胞的表型和特性发生改变，使T细胞免疫过程中出现Th1／Th2平衡向Th2漂移，Th1细胞因子分泌收到抑制，同时Th2细胞因子分泌增加，导致肿瘤组织处于深度的免疫抑制状态，便于肿瘤细胞通过分泌多种细胞因子，使肿瘤细胞外形、微环境和免疫表型改变，使其更加适宜浸润和转移。IL-4、IL-10是肿瘤组织中浸润淋巴细胞 （tumor infiltrating lymphocytes，TIL）分泌的关键因子，在TIL－IL-4－IL-10导致的肿瘤免疫抑制恶性循环中发挥重要作用，而TGF－β在促进肿瘤细胞的上皮间质转换以及促进肿瘤血管新生等方面发挥积极作用，但是口腔鳞癌中相关的研究目前少见报道。本实验利用免疫组化探讨口腔鳞癌组织内三者在肿瘤细胞和间质浸润淋巴细胞中的阳性分布规律以及与口腔鳞癌发展的关系。

1 材料和方法

1.1 组织标本

1997-01—2007-01月河北北方学院附属第一医院口腔颌面外科手术切除或活检标本鳞状细胞癌标本49例。取材部位：舌12例，牙龈12例，口底25例。其中高分化鳞状细胞癌20例，中分化鳞状细胞癌15例，低分化鳞状细胞癌14例；肿瘤体积小于3cm 26例，大于3cm 23例；伴有淋巴结转移30例，无淋巴结转移19例；Ⅰ、Ⅱ期25例，Ⅲ、Ⅳ期24例；浸润邻近脏器27例，无邻近脏器浸润22例；存在脉管内癌栓20例，无脉管内癌栓29例，以上结果再次经资深病理医师确认证实。

1.2 免疫组织化学试剂及主要染色步骤

IL-4、IL-10、TGF-β鼠抗人单克隆抗体均购于福建迈新生物技术有限公司。采用常规S-P法，各步骤间严格控制时间和温度，每次染色均以公司提供的阳性切片设置阳性对照，同时利用PBS代替单克隆一抗作为阴性对照。

主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，微波炉进行抗原热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1h，DAB显色10～15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。

1.3 结果判断及图像软件分析

着色细胞＜10%为阴性，＞10%为阳性。IL-4、IL-10、TGF-β阳性物质均定位在肿瘤细胞以及间质淋巴细胞的细胞浆。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，首先低倍镜寻找每张切片着色的典型区域，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，放大400倍镜下测量每个视场中阳性灰度单位，取其均数即为该切片的着色强度 （即灰度单位）。

1.4 统计学方法

采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析，IL-4、IL-10、TGF-β表达水平与肿瘤临床病例参数间的血管分析采用t检验，各指标表达水平的关系采用直线回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肿瘤组织IL-4、IL-10、TGF-β阳性细胞的分布特点及染色情况

肿瘤细胞及部分间质浸润淋巴细胞表达IL-4、IL-10、TGF-β，三种指标在肿瘤组织中的阳性表达有差异，中央区阳性细胞较多，呈现高水平表达，肿瘤浸润前沿内阳性细胞较少，表达水平明显降低，两区域指标的表达水平差异有统计学意义 （P＜0.05）。

2.2 肿瘤组织IL-4、IL-10、TGF-β阳性表达水平与口腔鳞癌病理参数关系

IL-4在口腔鳞癌的高分化组、无淋巴结转移组、无脉管内癌栓组表达明显低于相应中低分化组、有淋巴结转移组和存在脉管内癌栓组，同时其表达水平与细胞分化、淋巴结转移、脉管内癌栓密切相关（P＜0.05）；IL-10在口腔鳞癌Ⅰ、Ⅱ期无淋巴结转移组的表达明显低于相应Ⅲ、Ⅳ期和存在淋巴结转移组，其表达水平与临床分期、淋巴结转移密切相关（P＜0.05）；TGF-β在口腔鳞癌的体积较小组、无淋巴结转移组、无脉管内癌栓组表达明显低于体积较大组、有淋巴结转移组以及存在脉管内癌栓组，其表达水平与口腔鳞癌的体积、淋巴结转移、脉管内癌栓密切相关 （P＜0.05），见表1。

表1 IL-4、IL-10、TGF-β在口腔鳞癌的表达水平与临床病理特征的关系

2.3 IL-4、IL-10、TGF-β表达在肿瘤不同区域的血管分析分析

肿瘤中央区IL-4、IL-10、TGF-β表达水平之间两两密切相关（IL-4、IL-10间r＝0.661 7，P＜0.05；IL-10、TGF-β间r＝0.886 2，P＜0.05；IL-4、TGF-β间r＝0.573 1，P＜0.05），肿瘤浸润前沿组织中IL-4、IL-10表达存在明显相关 （r＝0.752 9，P＜0.05）。

3 讨 论

肿瘤细胞与间质内浸润细胞共同构成其生存的微环境，细胞间的相互作用伴随肿瘤的发生发展。研究发现浸润间质细胞与肿瘤细胞的相互作用与免疫逃逸密切相关，肿瘤的免疫逃逸可能存在以下机制：肿瘤细胞表面组织相容性抗原以及共刺激分子表达下降；肿瘤细胞表面抗原的突变或缺失；肿瘤细胞表面受体信号分子的改变；免疫抑制性细胞因子的生成 （VEGF、IL-10、PGF-2、IL-6、TGF-β）；T细胞功能缺陷，大量免疫抑制性调节性T细胞生成；抗原递呈细胞分化成熟、迁移异常，功能缺陷［1－4］。口腔鳞癌患者极易出现局部浸润和淋巴结转移，具体的机制尚不清晰，而新近研究提示免疫逃逸在肿瘤局部浸润和远处转移中发挥重要作用。

肿瘤细胞和间质细胞都可以分泌TGF－β，其进入细胞将内与SMADs结合，将信号传导细胞核内，增加细胞周期素依赖性蛋白激酶的抑制蛋白 （P15、P21、P27）的合成，使细胞停滞在G1期内，同时通过抑制c-myc抑制T细胞的增殖。肝脏是TGF的主要靶器官之一，小鼠四氯化碳酒精注射诱导的原发性肝癌，经门静脉灌注反义SMAD4cDNA后纤维化程度下降，肿瘤直径及数目减少，促进部分原癌基因的表达，抑制γ－干扰素的合成，抑制IL-18、IL-2受体表达，拮抗IFN－γ、IL-1的免疫反应［5－6］。同时促进Th2细胞过度产生IL-10和IL-4，从而抑制Th1类细胞因子的合成，下调MHC－Ⅱ类分子的表达，促进Th1／Th2平衡向Th2漂移，这样形成Th2细胞因子的强势分泌，机体抗肿瘤免疫处于抑制状态［7］。我们的实验显示TGF－β在口腔鳞癌的体积较小组、无淋巴结转移组、无脉管内癌栓组表达明显低于体积较大组、有淋巴结转移组以及存在脉管内癌栓组，其表达水平与口腔鳞癌的体积、淋巴结转移、脉管内癌栓密切相关。肿瘤中央区IL-4、IL-10、TGF-β表达水平之间两两密切相关。阳性细胞在口腔鳞癌中中央区的表达升高，说明TGF－β通过干预口腔鳞癌的免疫机制导致肿瘤免疫状态下降，便利其局部浸润和转移；同时TGF－β在促进肿瘤细胞的上皮间质转换过程以及血管新生等方面对肿瘤细胞都具有促进作用，增加了局部浸润和远处淋巴结转移的能力。

IL-4来源于肿瘤细胞、浸润的CD8阳性的T细胞，可抑制Th1介导Th2型细胞发育，促进肿瘤细胞产生IL-10启动因子，IL-10有可促进形成新的Th2性肿瘤浸润淋巴细胞，后者再促进IL-10的产生，从而形成TIL－IL-4－IL-10的恶性循环，是机体陷入深度的肿瘤免疫抑制状态。IL-10在早期肿瘤中有肿瘤细胞、浸润的淋巴细胞产生，晚期则由肿瘤细胞产生，正常机体的抗肿瘤免疫作用应以Th1介导的细胞免疫应答为主，但大多数肿瘤患者体内产生Th1／Th2漂移，表现为Th2细胞因子合成占优势［8－9］。IL-10可抑制Th1类细胞因子的合成，阻抑抗原呈递细胞在肿瘤组织的浸润，分化成熟和对抗原的趋化反应，诱导其表面HLA-1Ⅱ类分子CD68、CD86、CD40低表达或不表达。此外肿瘤细胞分泌的TGF能显著促进IL-10的分泌［10－12］。IL-4在口腔鳞癌的高分化组、无淋巴结转移组、无脉管内癌栓组表达明显低于相应中低分化组、有淋巴结转移组和存在脉管内癌栓组，同时其表达水平与细胞分化、淋巴结转移、脉管内癌栓密切相关 （P＜0.05）。IL-10在口腔鳞癌的Ⅰ、Ⅱ期无淋巴结转移组表达明显低于相应Ⅲ、Ⅳ期和存在淋巴结转移组；其表达水平与临床分期、淋巴结转移密切相关 （P＜0.05）。肿瘤中央区IL-4、IL-10、TGF-β表达水平之间两两密切相关。说明口腔鳞癌组织中存在TIL-IL4-IL10的恶性循环，导致Th1／Th2漂移产生，表现为Th2细胞因子高度分泌，使机体的免疫功能受到抑制，出现局部的浸润和淋巴结转移。尽管肿瘤间质内出现大量的浸润淋巴细胞，但是其免疫功能出现异常，抗原呈递能力下降，无法清除肿瘤细胞，相反其分泌的细胞因子便利肿瘤细胞变形、迁移和远处转移。

［1］Miyazono K，Ehata S，Koinuma D.Tumor-promoting functions of transforming growth factor-βin progression of cancer［J］.Ups J Med Sci，2012，117（2）：143-152.

［2］Jiang L，Lai Y K，Zhang J F，et al.Transactivation of the TIEG1confers growth inhibition of transforming growth factorβ-susceptible hepatocellular carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2012，18（17）：2035-2042.

［3］Liu Y，Sun R，Lin X，et al.Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-encoded microRNA miR-K12-11attenuates transforming growth factor-beta signaling through suppression of SMAD5［J］.J Virol，2012，86（3）：1372-1381.

［4］Dooley S，ten Dijke P.TGF-βin progression of liver disease［J］.Cell Tissue Res，2012；347（1）：245-256.

［5］Lin S，Yang J，Elkahloun A G，et al.Attenuation of TGF-βsignaling suppresses premature senescence in a p21-dependentmanner and promotes oncogenic Ras-mediated metastatic transformation in human mammary epithelial cells［J］.Mol Biol Cell，2012，23（8）：1569-1581.

［6］Chen G，Deng C，Li Y P.TGF-βand BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation［J］.Int J Biol Sci，2012，8（2）：272-288.

［7］Dobolyi A，Vincze C，Pál G，et al.The neuroprotective functions of transforming growth factor-beta proteins［J］.Int J Mol Sci，2012，13（7）：8219-8258.

［8］Pavone C，Caruana G，Abbadessa D，et al.Cytokine gene expression in the tunica albuginea of patients with Peyronie’s disease.Pilot study with a control group［J］.Urologia，2012，79（3）：189-196.

［9］L Ligeiro de Oliveira A P，Lino-dos-Santos-Franco A，Acceturi B G，et al.Long-term amphetamine treatment exacerbates inflammatory lung reaction while decreases airway hyper-responsiveness after allergic stimulus in rats［J］.Int Immunopharmacol，2012，14（4）：523-529.

［10］Poittevin M，Deroide N，Azibani F，et al.Glatiramer Acetate administration does not reduce damage after cerebral ischemia in mice［J］.J Neuroimmunol，2013，254（1-2）：55-62.

［11］Verghese B，Bhatnagar S，Tanwar R，et al.Serum cytokine profile in psoriasis-a case-control study in a tertiary care hospital from northern India［J］.Indian J Clin Biochem，2011，26（4）：373-377.

［12］Nogueira C M，de Azevedo W M，Dagli M L，et al.Titanium dioxide induced inflammation in the small intestine［J］.World J Gastroenterol，2012，18（34）：4729-4735.