抑菌微生态制剂替代饲用抗生素技术研究

丁文秀，李 震，李敬忠，徐玉新*

(1.山东农业大学 资源与环境学院，山东 泰安 271008;2.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000;3.泰安市泰山区环境保护局，山东 泰安 271000)

1 前言

20世纪40年代来，抗生素作为饲料添加剂及兽药来预防治疗疾病和促进生长［1］。然而，大量使用抗生素使动物产生耐药性［2］，动物体内残留的抗生素通过食物进入人体［3］，病原菌的抗药性对人体健康存在威胁［4］。日本和美国等对饲料中添加抗生素做出严格的限制［5］。

具有防病、促生长的饲料添加剂除抗生素外，还有微生态制剂［6］。微生态制剂是根据微生态理论，从动物体内外分离的对动物有益微生物，经特殊加工制成含有益微生物及其代谢产物的活菌制剂［7］。微生态制剂有无耐药性、无残留特点而成为替代抗生素的良好选择。本文突破以往微生态制剂只注重营养作用观点，从抗菌性能评价微生态菌株，研究饲用抗生素的替代品，减少使用抗生素所引起的食品安全、病原菌耐药性和环境问题。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌株 芽孢杆菌筛选试验前处理菌株:N9、枯草芽孢杆菌(妈咪爱)、地衣s、冷1#、纳豆1、纳豆4、BT123、蜡样芽孢杆菌。

候选菌株:纳豆2、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌B7348、丁酸梭菌。

芽孢杆菌初筛病原性指示菌:猪大肠杆菌1565、藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌。

芽孢杆菌复筛病原性指示菌:鸡大肠杆菌1565、猪大肠杆菌2116、鸡伤寒沙门氏菌C79－20、鸡白痢沙门氏菌C79－13、猪大肠杆菌249、金黄色葡萄球菌。

乳酸菌筛选试验菌株:嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌(LP)、戊糖片球菌(PP)、嗜热链球菌、乳酸链球菌、RDH 乳球菌。

乳酸菌筛选试验病原性指示菌:鸡大肠杆菌1565、猪大肠杆菌2116、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌N9、地衣芽孢杆菌s、B7348(实验室保存菌株)。

2.1.2 培养基 MRS 培养基，营养肉汤培养基。

2.1.3 试验器材 XSS－600 显微镜，500 型恒温培养箱，JHT 型净化工作台，LD5－2A 型离心机，pHS－3C 型精密pH 计，BC－163K 型冰箱，GUJS－7A 型实验发酵罐，TCYQ 型恒温振荡器，LD4－40 型离心机，FA1004 型电子天平，UV－2000 型紫外可见分光光度计等。

2.1.4 其他材料 海兰褐雏公鸡，AA+白羽肉鸡，乳酸菌发酵物及抗生素氧氟沙星(2%)、阿散酸。安全性试验基础日粮(玉米64%，豆粕28%，鱼粉3%，蛋鸡预混料5%)。免疫效率试验基础日粮(玉米59.67%，大豆粕35%，石粉1.4%，磷酸氢钙1.5%，蛋氨酸0.1%，赖氨酸0.1%，植物油1.6%，食盐0.3%，氯化胆碱0.1%，肉鸡－微量0.2%，肉鸡－多维0.03%)。

2.2 试验方法

2.2.1 芽孢杆菌初筛 (1)试验菌株前处理:芽孢杆菌属菌株用培养基(1.5%葡萄糖，3.0%黄豆饼粉，0.2%蛋白胨，0.1%NaCl，0.5% (NH4)2SO4，0.6%CaCO3，0.6%MgSO4)30 ℃、pH为7.2～7.5 下液态培养48 h 后，芽孢生成率达10%可用于试验。按无菌操作取试验菌培养液10000 rpm 离心10 min，取上清液待用。病原性指示菌由培养基(0.2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%牛肉膏)在pH 7.0，37 ℃下液态培养24 h。培养所得病原性指示菌试验前稀释100 倍。(2)微生态制剂菌株的筛选抑菌试验:每个平板上放置牛津杯，杯间距离相等。取双层培养基平板，每个小杯加满上清液，培养36 h 观察并测量抑菌圈直径。

2.2.2 芽孢杆菌复筛 通过初筛，确定复筛范围，增加候选菌株作为筛选来源。对初筛中有抑菌作用的菌株培养，培养条件同初筛。培养后的芽孢杆菌，经10000 rpm 离心10 min，取上清液，置4 ℃保存备用。选取指示菌在试验前经24 h 培养，660 nm 测定光密度值。试验前稀释100 倍，以光密度值0.2～0.3为宜。复筛菌株抑菌试验同初筛。

2.2.3 pH 值对芽孢杆菌抑菌效果影响 试验用菌株(地衣s和芽孢杆菌B7348)培养条件同复筛，结束培养后，芽孢生成率达10%可用于试验。按无菌操作将发酵液pH 调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 离心10 min，取上清液待用。空白培养基pH 调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 离心10 min，取上清液待用。

2.2.4 复筛菌株的产酶性能试验 用福林法测定B7348、冷1#和N9 的中性蛋白酶活力。

2.2.5 乳酸菌的筛选 乳酸菌用MRS 液体培养基，37℃培养24 h，10000 rpm 离心分离菌体和上清液。指示菌用营养肉汤培养基，37℃摇床培养24 h。用牛津杯法测定各乳酸菌菌株对指示菌抑菌效果。

2.2.6 乳酸菌耐受试验 (1)乳酸菌酸耐受试验:用100 mL 盐水瓶装量培养基100 mL，接种LP、嗜酸乳杆菌、PP 试验菌株，37℃摇床低速培养24 h。将发酵液用HCl 调pH为2.0、2.5、3.0，37℃培养，每隔0.5h取样计数。

(2)乳酸菌胆盐耐受试验:用100 mL 盐水瓶装量培养基100 mL，接种上述三种菌株，37℃摇床低速培养24 h。将发酵液猪胆盐浓度调成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃培养10 min，取样计活菌总数。

2.2.7 后备菌株代谢产物中有效抑菌成分初步分析 用SDS－PAGE 方法分析。胶浓度为15%，样品上样量20μL，Maker 上样量10μL。芽孢杆菌菌体、芽孢杆菌培养液、芽孢杆菌培养液10000 rpm 离心5 min，取上清液。加至1、2、3 泳道分析。乳酸菌菌体、乳酸菌培养液、乳酸菌培养液10000 rpm 离心5 min，取上清液。加至4、5、6 泳道分析。

2.2.8 菌种安全性试验 将B7348 发酵后喷雾干燥，制成喷干菌粉。将LP－11 发酵后真空冷冻干燥，制成冻干菌粉。对两种菌粉进行计数。分别稀释成含1×108个活菌菌粉。将供试菌种加到实验动物的基础日粮中，添加比例为0.5‰(1 组)、1‰(2 组)、2‰(3 组)、5‰(4 组)、10‰(5 组)。

试验动物以基础日粮预饲一周，称重后随机分十个试验组和一个对照组，其中五个组添加B7348，为7(1)、7(2)、7(3)、7(4)、7(5)组;五个组添加LP－11，为N(1)、N(2)、N(3)、N(4)、N(5)组;对照组不加菌粉，每组样本20 只。经两周生长试验，称重计算增重率并解剖观察器官。

2.2.9 菌种免疫效率试验 AA+白羽肉鸡120 只，随机均分为四组。一组空白(Ck 组:不添加菌种和抗生素)，两组添加供试菌种(Ⅰ、Ⅱ组为添加不同剂量供试菌种组)，一组添加抗生素(Ⅲ)。使用鸡沙门氏菌染毒并观察发病率和病死率。各试验组日粮组成及含量见表1。

表1 各试验组日粮组成及含量Table 1 The composition and content of diet group

3 结果与分析

3.1 芽孢杆菌初筛

芽孢杆菌初筛结果见表2。

表2 芽孢杆菌初筛结果Table 2 The results of Bacillus early sifting

初筛试验发现:枯草芽孢杆菌(妈咪爱)、纳豆1 对采用的指示菌没有明显抑制作用;N9、地衣s、冷1#、纳豆4、BT123 至少对两种指示菌具有明显抑制作用，蜡样芽孢杆菌只对金黄色葡萄球菌有抑制作用。

3.2 芽孢杆菌复筛

芽孢杆菌复筛结果见表3。

表3 10株芽孢杆菌对指示菌的抑菌效果(单位:mm)Table 3 The antibacterial effect of 10 strains of bacillus instructions(unit:mm)

表3 有5株芽孢杆菌对指示菌产生相对较强的抑菌作用，即冷1#、地衣s、纳豆2、N9、7348。

表4 复筛后五株芽孢杆菌的抑菌圈(单位:mm)Table 4 Five strains bacillus bacteriostatic circle after seconf sifting(unit:mm)

表4:5株芽孢杆菌对6 种指示菌有不同程度的抑菌作用，枯草芽孢杆菌B7348 对革兰氏阳性致病菌－金黄色葡萄球菌，抑制效果十分明显。

3.3 pH 值对芽孢杆菌抑菌效果影响

(1)不同pH 值对地衣s 抑菌效果的影响

以抑菌圈平均值(X)表示不同pH 值对地衣s 的抑菌效果，见表5。

表5 pH 值对地衣s 抑菌效果的影响(mm)Table 5 The antibacterial effect about pH on Bacillus Licheniformis s(mm)

在所设的pH 值下:地衣s 对藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌均具有不同程度的抑菌作用，而且对金黄色葡萄球菌的抑制能力比对藤黄八叠球菌强;而对大肠杆菌、沙门氏菌无抑菌作用。

(2)不同pH 值对B7348 抑菌效果的影响

不同pH 值对B7348 抑菌效果以抑菌圈平均值(X)表示，见表6。

表6 pH 值对B7348 抑菌效果的影响(mm)Table 6 The antibacterial effect about pH on B7348(mm)

在所设pH 值下:B7348 对7 种指示菌有不同程度的抑菌效果;且对同一指示菌，B7348 抑菌效果没有明显差别。B7348 的抗菌性对所设pH 不敏感。芽孢菌结束培养后，pH为7.0 左右抑菌效果较好，培养无需调整pH 值。

3.4 复筛菌株的产酶性能试验

复筛菌株的产酶性能试验结果见表7。

表7 中性蛋白酶测定结果Table 7 The determination result of neutral protease

表7:B7348 中性蛋白酶活力最高，中性蛋白酶活力可达140 U/mL，明显高于其他2株筛选菌株。

3.5 乳酸菌的筛选

不同乳酸菌菌株对指示菌菌株的抑菌结果见表8。

表8 不同乳酸菌抑菌效果(单位:mm)Table 8 The bacteriostatic effect of different Lactic acid bacteria

表8:LP、嗜酸乳杆菌、PP 对指示菌中致病菌抑制效果较明显且对芽孢菌的抑制相对较弱。

3.6 乳酸菌耐受试验

(1)乳酸菌的酸耐受试验

乳酸菌酸耐受试验结果见表9。

表9 不同乳酸菌耐受结果(cfu/ml)Table 9 The result of acid tolerence about different Lactic acid bacteria

表9:该三种乳酸菌在pH 值为2.0 时，2 h 后不能耐受。相较于其他2株菌株，酸的耐受能力尤以植物乳杆菌最强。

(2)乳酸菌的胆盐耐受试验。

乳酸菌胆盐耐受试验结果见表10。

表10 不同乳酸菌胆盐耐受结果Table 10 The result of cholate tolerance about different Lactic acid bacteria

表10:胆盐对三株乳酸菌的生长有一定的抑制作用，在0.2%的胆盐浓度下，活菌数仍然保持在108，在0.3%、0.4%和0.5%胆盐浓度下活菌数呈梯度下降趋势。但戊糖片球菌的耐受性比另两株乳杆菌强。

通过筛选，考虑菌株抑菌性和生物特性，选择芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP－11为后备菌株。芽孢杆菌B7348 对革兰氏阳性菌抑制效果较好，而植物乳杆菌LP－11 对革兰氏阴性菌抑制效果明显，联合使用效果更佳。芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP－11 是在现有菌株基础上筛选得到，培养发酵条件经优化，液体深层发酵过程中能达到109cells/ml和1010cells/ml。

3.7 后备菌株代谢产物中有效抑菌成分初步分析

芽孢杆菌B7348 SDS－PAGE 分析见图1。乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析结果见图2。

图1 芽孢杆菌B7348 SDS－PAGE 分析Fig.1 The analysis on SDS－PAGE about Bacillus

图2 乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析Fig.2 The analysis on SDS－PAGE about Lactic acid bacteria

芽孢杆菌B7348 在8 kd 左右出现三条浓密的条带，从分子量上分析，此三条带均为小分子肽类物质。其培养液上清及沉淀中出现此条带，说明芽孢菌B7348 能分泌出这种活性小肽。对乳酸菌LP－11 的蛋白成分进行分析，结果与芽孢杆菌相似。乳酸菌LP－11 主要成分分子量为3.5 kd 左右，说明该株乳酸菌主要抑菌物质为分子量更小的抗菌肽类物质。通过检验抑菌活性，发现乳酸菌LP－11 有较好的抑制指示菌作用。

3.8 菌种安全性分析

饲喂试验的结果见表11。

表11 增重率实验结果(%)Table 11 The experimental results of weight increasing rate

经两周饲喂后，雏鸡生长发育正常，观察雏鸡外观及粪便未见异常。解剖学性状未见异常，具体见图3。

图3 安全性试验部分脏器Fig.3 The part organs safety test

图3:添加最高剂量B7348 的5 组的脏器与对照组相比未发现异常，初步断定用于养殖动物的饲喂是安全的。表11:7(2)7(3)7(4)7(5)N(1)N(3)N(4)等组增重率均高于对照组。

3.9 菌种免疫效率试验

肉鸡染毒后指标见表12。

表12 肉鸡染毒后指标Table 12 The index of chiken after poison attack

表12:对照组发病率和病程明显高于其它各组。从发病率来看，第Ⅱ组、第Ⅲ组相同，低于第Ⅰ组。从病程来看，第Ⅱ组最短，第Ⅰ组和第Ⅲ组相同。病死率第Ⅱ组、第Ⅲ组为0。综上所述，添加菌种的第Ⅱ组实验结果最好。

4 结论

筛选出的抑菌性芽孢杆菌B7348和乳酸菌LP－11 无论在菌种安全性还是在免疫效率方面有出色表现，两者合理搭配可替代饲用抗生素在饲料中的使用。用两株益生菌及其代谢产物，在提高抵抗力，减少发病率方面，已达到和超过饲用抗生素效果。微生态制剂有抗生素无法比拟的天然优势，将会成为人们关注的焦点。

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