HPLC法测定壮骨止痛颗粒中延胡索乙素的含量

谢宪斌，王巨存

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津市天津医院药剂科，天津 300211）

壮骨止痛颗粒是天津医院应用多年的中药制剂，由淫羊藿、蛇床子、延胡索组成，具补肾壮骨、活血止痛功能，用于绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症的治疗。方中延胡索所含延胡索乙素具有镇痛作用[1]。为有效控制该制剂质量，在前期工作的基础上[2]，本试验采用高效液相色谱法对延胡索乙素进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 W1aters高效液相色谱仪（515HPLC泵、486紫外检测器、Millennium2010色谱工作站，美国）；UV-240紫外分光光度计（日本岛津）；AUW120电子分析天平（日本岛津）；TCQ250型超声波清洗器（北京医疗设备二厂）。

1.1.2 试剂 延胡索乙素对照品（批号：110726-201112）购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为注射用水，其余试剂均为分析纯。壮骨止痛颗粒样品（批号 120302，120517，120720，规格：10 g/袋；由天津医院制备）。

1.2 方法

1.2.1 检测波长的选择 取延胡索乙素对照品甲醇溶液在190～400 nm的波长范围内扫描，结果溶液在280 nm波长处有最大吸收,故确定检测波长为280 nm。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Symmetry C18（150mm×3.9mm，5μm）；流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液（34∶66）（三乙胺调 pH 值至 6.5）；流速为 0.8mL·min-1；检测波长为280 nm；柱温：25℃。进样量：20μL。在该色谱条件下进行试验，主峰应与其它峰分离度大于1.5,理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。

1.2.3 提取条件的选择

1.2.3.1 提取溶剂：取同一批号（120302）样品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或碱性甲醇（浓氨试液-甲醇比例1:20）50mL,称定重量，超声（250W,40 KHz）提取 60min，放冷，再称定各自重量，用相应溶剂补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中延胡索乙素的含量（n=3）。甲醇提取结果为0.019 2mg/g，碱性甲醇提取结果为0.019 5mg/g。两种溶剂对延胡索乙素的提取无明显影响（RSD=1.10%）。

1.2.3.2 提取方式：取同一批号(120302)样品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，分别采用超声处理与加热回流的方式，提取60min，放冷，再称定各自重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中延胡索乙素的含量（n=3）。超声提取结果为0.019 4mg/g，回流提取结果为0.019 8mg/g，两种方式对延胡索乙素的提取无明显影响（RSD=1.44%）。

1.2.3.3 提取时间：取同一批号（120302）样品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，分别超声处理 30、60、90min，放冷，再称定各自重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中延胡索乙素含量（n=3）。30min提取结果为0.0183mg/g，60min提取结果为0.0191mg/g，90min提取结果为0.019 5mg/g。30与60min测定结果的RSD为3.02%，60与90 min测定结果的RSD为1.46%。故超声提取60min较为适宜。

1.2.3.4 提取溶剂用量：取同一批号(120302)样品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30mL或50mL，称定重量，超声处理60min，放冷，再称定各自重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中延胡索乙素的含量（n=3）。30mL提取结果为0.017 6mg/g，50mL提取结果为0.019 2 mg/g，30mL与50mL测定结果的RSD为6.15%。因此，以甲醇50mL为提取溶媒。

1.2.4 溶液的制备

1.2.4.1 对照品溶液：取经五氧化二磷减压干燥24 h的延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得。

1.2.4.2 供试品溶液：取样品适量，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4.3 阴性对照溶液：取缺延胡索的阴性样品，按“1.2.4.2”项下方法制成阴性对照溶液。

1.2.5 方法专属性 在上述色谱条件下，分别取延胡索乙素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入色谱仪。供试品色谱图中，在与延胡索乙素对照品色谱相应的位置上，有一相同保留时间的色谱峰。而阴性对照溶液在此保留时间处无干扰，见图1。

1.2.6 线性关系考察 取延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.04mg/mL的溶液，作为储备液，再分别稀释成浓度为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的对照品溶液，分别精密吸取上述5种浓度的对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按“1.2.1”色谱条件分析，测定各自峰高，以对照品浓度（mg/mL）为横坐标，峰高值为纵坐标，求得回归方程：Y=6.981×105X+1.376×103，r=0.999 6。结果表明延胡索乙素在0.005～0.025mg/mL范围内线性良好。

1.2.7 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样5次，测定延胡索乙素峰高，RSD为1.32%，表明仪器精密度良好。

1.2.8 稳定性考察 取同一对照品溶液，分别于0、4、8、24、48、72 h 进样，测定峰高值，RSD 为 1.38%，表明对照品在72 h稳定性良好。取同一供试品溶液，分别于 0、4、8、24、48、72 h 进样，测定峰高值，RSD为1.52%，表明供试品在72 h稳定性良好。

1.2.9 重复性试验 取同一批号样品，共6份，研细，取约5 g，按照“1.2.4.2”供试品溶液制备操作，测定每份样品中延胡索乙素含量，RSD为1.65%，表明重复性良好。

1.2.10 回收率试验 取同一批号样品，研细，取约5 g，共6份，精密称定，分别加入延胡索乙素标准储备液（0.04mg/mL）2.35mL，再按照“1.2.4.2”供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“1.2.2”色谱条件分析，计算回收率见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）Tab1 Resultof samp le recovery tests（n=6）

2 结果

取3个批号的样品，按照“1.2.4.2”供试品溶液制备操作，按“1.2.2”色谱条件测定样品中延胡索乙素含量。结果见表2。

表2 3批样品测定结果(n=3)Tab2 Content determ ination resultsof samp les（n=3）

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 试验中选择了3种不同色谱柱，并以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.5）（55∶45）[3]和乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺调 pH值至 6.5）（35∶65）[4]为流动相，结果表明延胡索乙素在 Thermo BetaBasic-18（250mm×4.6mm，5μm）、Elite YWGC18（250mm×4.6mm，10μm）均严重拖尾（文献也有类似报道[5-9]），改变流动相的比例和pH均无变化，换用Waters Symmetry C18(150mm×3.9 mm，5μm)后得到了理想的峰形。延胡索乙素的化学结构含有淑氮原子，可能与C18柱的残余硅羟基产生相互作用从而产生拖尾现象。YWGC18未经端基封尾，Thermo BetaBasic-18和 Waters Symmetry C18都经过端基封尾，但前者仍产生拖尾，这可能与其它的填料参数有关。试验结果提示，上述两种流动相适合分离延胡索乙素，但要选择合适的色谱柱。

3.2 流动相的选择 延胡索乙素的HPLC分析以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.0）（60∶40）和乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.0）（35∶65）为流动相较为有代表性。本试验结果表明，前者柱压较高，后者柱压较低，故选后者，但35∶65的比例阴性对照有干扰，改为34∶66后则消除了阴性对照的干扰。此外，若0.1%磷酸溶液换成纯水，则延胡索乙素的峰形很差，提示0.1%磷酸溶液是必需的。

3.3 流动相pH的选择 试验中选择了3种不同pH值，分别是5.5、6.0、6.5，在这3种pH下，延胡索乙素的峰形都较好，但pH5.5导致出峰时间前移较多（9.8分）影响样品分离。在本试验条件下，pH6.5的峰形较pH6.0更好，故pH选择6.5。

3.4 提取条件的选择 甲醇、碱性甲醇对延胡索乙素的提取无明显差异（RSD=1.10%），其原因可能与该制剂中各味药材经水提而非药材粉末有关，但甲醇比碱性甲醇使用更方便，故本方法采用甲醇为提取溶媒；回流提取与超声提取对测定结果无明显影响（RSD=1.44%），但后者较为简便，故采用超声提取；在提取时间方面，60min的测定结果高于30min（RSD=3.02%），但60min与90min差异不明显（RSD=1.46%），故提取时间确定为60min；在提取溶剂用量方面，50mL的测定结果高于30mL（RSD=6.15%），故提取溶剂用量确定为50mL。

综上，在文献方法[4]的基础上对色谱柱进行了选择，对流动相的比例进行了调整，新的色谱方法专属性强。经过对提取条件较为详尽的考察，发现所确定条件操作简便，结果准确可靠。

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