中药有效成分对荷视网膜母细胞瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表达及血清细胞因子水平的影响

陈 卓，于卫江

(郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院药剂科，郑州 450008)

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)包括天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞，Treg与自身免疫性疾病的发生密切相关，其表达异常可导致自身免疫性疾病。自然调节性T细胞主要为CD4+CD25+Treg，CD4+CD25+Treg除表达CD4+分子和CD25+分子外，其特征标志为其高表达转录因子Foxp3。此外，Foxp3还是决定CD4+CD25+Treg功能的关键基因。CD4+CD25+Foxp3+Treg能够抑制小鼠和大鼠的自身免疫性疾病，诱导对移植物的免疫耐受，阻碍抗肿瘤免疫应答的发生，并抑制CD4+CD25+和CD8+T细胞的活化与增殖。

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)系一种原发于视网膜组织的眼内恶性肿瘤，多见于3岁以下幼儿，约89%发生于3岁以前，单眼发病较多约占60%～82%。目前普遍认为，其发病机理是由于抗癌基因的失活才导致细胞恶变的发生。研究发现，导致RB发生的起始原因是视网膜母细胞瘤基因(Rb)的2次突变，并且Rb基因缺失的个体发生RB的几率比其他肿瘤高2000倍。研究表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg水平升高是肿瘤免疫抑制的重要途径之一，且荷视网膜母细胞瘤移植鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg的细胞数量与正常小鼠相比明显高出很多，利于肿瘤耐受的形成，抑制免疫系统对肿瘤的免疫应答，进而促进肿瘤的发生和发展。本文将探讨中药有效成分对荷视网膜母细胞瘤小鼠脾CD+CD25+Foxp3+Treg表达及相关细胞因子水平的影响。

1 材料

1.1 动物

本实验经过动物伦理委员会的批准，4～6周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠80只，体质量15.64±3.18g，小鼠体质量组间比较差异无统计学意义。由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证号SCXK-2005-0013)，中国中医研究院广安门医院动物室喂养(许可证号SYXK(京)2005-0001)。荷视网膜母细胞瘤由中国医学科学院药物研究所提供。

1.2 药物

黄芪、党参购自河南省食品药品检验所。

1.3 仪器

FACSCalibur分选型流式细胞仪(美国BD公司)、SM800解剖显微镜(日本 Canon)、SIAFRT SYNERGYHT多功能酶标仪(美国BIO-TEK)。

1.4 试剂

FITC标记抗小鼠CIM(德国Miltenyi Biotic公司)，APC标记抗小鼠CD25+、PE标记抗小鼠Foxp3(美国EBioscience公司)，流式微球阵列自由组合试剂(IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70，美国 BD 公司)。

2 方法

2.1 动物模型复制

取传代后12d荷视网膜母细胞瘤荷瘤小鼠，剥离瘤组织，选取生长良好的肿瘤组织，制备荷视网膜母细胞瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL(约含活细胞数1×106个)。

2.2 分组给药

小鼠接种后随机分为黄芪组、党参组、黄芪+党参组和对照组4大组，每大组20只。接种后24h始至处死止每日灌胃给药1次。荷瘤对照组给予生理盐水灌胃0.3mL/d，各组中药浸膏用无菌水稀释，黄芪组给予黄芪溶液(30mg/kg/d)，党参组给予党参溶液(20mg/kg/d)，黄芪 +党参组给予黄芪溶液(30mg/kg/d)+党参溶液 (20mg/kg/d)，均为灌胃给药。

2.3 观察指标

2.3.1 黄芪、党参及其组方对小鼠瘤重和体质量的影响 将每大组20只小鼠再随机分为5d组、10d组、15d组和20d组共4小组，每小组5只。分别于接种后5、10、15、20d处死小鼠，称荷瘤小鼠体质量剥离肿瘤组织，精确电子天平称取瘤重。小鼠体质量=荷瘤小鼠体质量－瘤重。

2.3.2 黄芪、党参及其组方对小鼠抑瘤率的影响 于接种后5、10、15、20d处死小鼠剥离肿瘤组织，精确电子天平称取瘤重，按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率(%)=［1－实验组平均瘤重(g)/对照组平均瘤重(g)］×100%。

2.3.3 黄芪、党参及其组方对小鼠荷视网膜母细胞瘤转移抑制率的影响 将各用药组及对照组的20d组小鼠处死，剥离小鼠视网膜生理盐水冲洗，Bouin氏液固定，解剖显微镜下观察荷视网膜母细胞瘤转移灶个数。荷视网膜母细胞瘤转移抑制率(%)=［1－实验组平均荷瘤转移灶个数(个)/对照组平均荷瘤转移灶个数(个)］×100%。

2.3.4 黄芪、党参及其组方对荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表达的影响 于接种后5、10、15、20d摘眼球取血，断颈处死小鼠酒精消毒皮肤，迅速取脾、称重、研磨，200目滤网滤过包膜及脂肪组织等，加入2mL PBS，收集脾细胞悬液计数细胞，取约1×106个细胞重悬于100μL PBS中，按照试剂说明书进行FITC-CD4、APC-CD25染色、破膜，PE-Foxp3染色上机检测。

2.3.5 血清细胞因子水平检测 (1)样本采集:于接种后20 d小鼠摘眼球取血，室温凝固4h，4000r/min离心20min，收集上清待测;(2)小鼠血清 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ 水平用流式微球阵列技术 (CBA)检测。①仪器调整:使用CBA FLEXSET试剂盒中的Cytometer Setup Beads设定参数;②标准品制备:使用CBA FLEX-SET试剂盒中的细胞因子标准品按照梯度法稀释为6000、3000、1500、1250、715、357、178、89、45、0ng/L10 个浓度;③制备样品及分析:取待测血清50μL置于PE管，加入50μL捕获微球混合物，50μL PE标记检测抗体，室温避光孵育4h，加入2mL洗液，150g×6min洗2次，加入200μL洗液上机检测，BD CBA软件进行数据分析。

2.4 统计学方法

应用SPSS 11.0软件统计分析，数据结果以均值±标准差(珋x±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析(P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠瘤重及体质量动态变化

20d黄芪组和黄芪+党参组荷瘤小鼠瘤重分别为(3.38±1.53)g、(2.97 ±1.36)g，明显低于荷瘤对照组小鼠瘤重(4.14±1.86)g(P＜0.05)，15d黄芪+党参组荷瘤小鼠瘤重(2.73±1.27)g低于荷瘤对照组小鼠瘤重(3.68±1.83)g(P＜0.05)，其他各时间点各组瘤重无差异。各组小鼠体质量随天数的增加呈下降趋势，20d黄芪组体质量(17.06±2.53)g高于荷瘤对照组(12.95±1.74)g(P＜0.05)，20d黄芪+党参组体质量(17.48±2.16)g高于荷瘤对照组(12.95±1.74)g(P＜0.05)，其他各时间点各组体质量无差异。

3.2 荷瘤小鼠抑瘤率动态变化

表1显示，黄芪组小鼠和黄芪+党参组小鼠肿瘤抑制率均明显高于党参组小鼠的肿瘤抑制率(P＜0.01)，而各时间段黄芪组小鼠肿瘤抑制率与黄芪+党参组比较差异无统计学意义。各中药有效成分组抑瘤率在用药前期较为可观，但随着给药天数的增加，各中药有效成分组抑瘤率逐渐下降。

表1 各组肿瘤抑制率比较(%，n=5)

3.3 荷瘤小鼠荷视网膜母细胞瘤转移抑制率

表2显示，20d黄芪+党参组荷视网膜母细胞瘤转移抑制率为46.61%，视网膜母细胞瘤转移灶个数显著低于荷瘤对照组、黄芪组及党参组(P＜0.01)。

3.4 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表达动态变化

图1、表 3显示，对照组小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Treg表达随荷瘤天数的增加呈上升趋势，各中药组小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表达在肿瘤病程中均呈下降趋势。20d小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表达3个中药组低于荷瘤对照组(P＜0.05)，15d黄芪+党参组CD4+CD25+Foxp3+Treg表达低于荷瘤对照组(P＜0.05)。

表3 各组荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比动态变化(%，珔x ± s，n=5)

图1 各组荷瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比变化直方图

3.5 荷瘤小鼠血清细胞因子水平比较

表4显示，黄芪组、党参组和黄芪+党参组小鼠血清IL-10水平均低于荷瘤对照组(P＜0.05);黄芪组、党参组和黄芪+党参组小鼠血清IL-2及IFN-γ水平均高于荷瘤对照组(P＜0.05)，而IL-6、IL-12p70水平各组与荷瘤对照组比较差异无统计学意义。

4 讨论

早在20世纪90年代初，就有报道人类肿瘤中有一类起抑制作用的T细胞，但直到20世纪90年代中期，Treg被分离出后，关于人类肿瘤中Treg是否增多的研究才逐渐增多。Woo等首次报道在非小细胞肺癌和卵巢癌的肿瘤浸润淋巴细胞中Treg增多。这些Treg分泌TGF-β为Treg导致机体免疫低反应性首次提供依据。Curiel等证明，在卵巢癌患者中，CD4+CD25+Foxp3+Treg抑制肿瘤特异性T细胞的免疫活性，有助于肿瘤的生长、进展。又有Larmonier研究证实，荷瘤小鼠体内Treg数目增多。Treg通过下调转录核因子-κB的活性来影响树突状细胞的功能，而被抑制的树突状细胞表面CD80、CD86和CD40的表达水平及分泌产生的IL-2、TNF-α均显著降低，使之发挥免疫负性调节作用。临床研究也表明，肿瘤复发则患者体内Treg数目有明显增高，肿瘤增长与Treg细胞数目之间有明显关系。在本研究中，黄芪和党参的中药组方明显下调荷瘤小鼠IL-10的水平及CD4+CD25+Foxp3+Treg表达，可能是与化疗药物类似，通过抑制肿瘤微环境中的血管生成，促进Treg凋亡，使Treg数目减少，T细胞和NK细胞的作用恢复，从而起到有效控制肿瘤的作用。CD4+CD25+Foxp3+Treg的减少导致IL-10的分泌量减少，从而抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg参与肿瘤免疫逃逸及对机体免疫的抑制作用。

表4 20d各组小鼠血清细胞因子水平比较(ng/L，珔x±s，n=5)

中医认为气虚是肿瘤的重要病理因素，黄芪属于传统益气中药，在体内具有广泛的免疫增强作用;党参具有补中益气之功效，含有萜类、糖和糖苷类、甾体类等多种化学成分，有提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤等功能。本研究中，黄芪组和黄芪+党参组在改善荷瘤小鼠体质量及抑瘤率方面具有明显功效，而在抑制肿瘤转移方面则以黄芪+党参组为最佳。同时3个中药组都能明显下调CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比，不同中药对荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表达的变化趋势有不同影响。黄芪+党参组方较其单味药党参、黄芪有较好的抑瘤、抗转移、下调 CD4+CD25+Foxp3+Treg表达、下调IL-10水平的作用。综合以上结果可以认为，中药黄芪+党参组方可明显抑制肿瘤的发生与发展，并可有效改善机体的细胞免疫效应，这一结果也可为研究者探析中药及其组方的抑癌机制及在改善西医化疗效果方面提供一些新思路和新对策。

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