TGF-β1在大肠侧向发育型肿瘤中的表达及意义

胡 毅，丁 玲，周 钢，邹胜智

重庆市江津区中心医院消化内科，重庆 402260

大肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor，LST)首先由日本学者工藤进英博士提出。此种肿瘤因其极少向肠壁深层垂直侵犯，而主要沿黏膜表面呈侧向浅表扩散，故称之为侧向发育型肿瘤[1]。LST的病变形态及发生、发展规律不同于一般的腺瘤，有其特殊性。国内外研究均表明，LST存在较高程度的恶变风险，因此应及早诊断并行内镜下治疗[2]。而有关LST的生物学特殊性及其与大肠癌关系的具体分子机制目前仍不清楚，需要进一步的研究。转化生长因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是 TGF-β超家族的主要成员，大量研究表明，它与肿瘤关系密切，在肿瘤产生初始阶段，发挥抑制细胞增殖及促凋亡作用，而在肿瘤进展期，则有促进肿瘤细胞增殖、浸润和转移的作用[3]。目前尚未见TGF-β1在LST表达情况的报道，本研究将观察LST中TGF-β1基因及蛋白表达水平，并与腺瘤性息肉及大肠癌进行比较，初步探讨LST发生发展的分子机制。

1 资料与方法

1.1 病例及标本 12例大肠侧向发育型肿瘤、12例腺瘤性息肉组织及正常大肠黏膜组织均来自重庆市江津区中心医院2010年5月－2012年3月的内镜下手术标本。16例大肠癌组织来自重庆市江津区中心医院2011年5月－2011年11月的外科手术标本。所有标本均于－80℃冰箱保存。

1.2 仪器与试剂 PCR仪为美国Thermo公司产品。TRIzol、逆转录试剂盒购自QIAGEN公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成，凝胶成像系统为BIO-RAD公司产品。TGF-β1兔抗人单克隆一抗购自SantaCruz生物技术公司，β-actin兔抗人单克隆一抗及相应辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德公司，蛋白裂解液和ECL发光试剂盒购自Sigma公司。

1.3 qRT-PCR法检测TGF-β1 mRNA表达情况参照试剂盒说明提取组织中的总RNA并进行逆转录及PCR扩增反应。TGF-β1引物:Sense 5'-TGCAGCTACCCCGTTAGCT-3'，antisense 5'-AGCAGTGCAAATTACTGG-3'。β-actin 引物:Sense 5'-GTCAATGACTCGAGGCCA-3'，antisense 5'-TACTTCGTCGAAGCACAA-3'。循环扩增条件为:在93℃ 2 min进行预变性;循环40个周期，顺次包括93℃ 60 s，55℃ 60 s以及72℃ 20 s;最后在72℃条件下延伸7 min。TGF-β1扩增产物长度为169 bp。每个样品均重复检测3次。采用2ΔCt法计算TGF-β1 相对表达量(ΔCt=TGF-β1 Ct-β-actin Ct)[4]。

1.4 Western blotting法检测 TGF-β1蛋白表达水平将组织匀浆后提取总蛋白，BCA法测定总蛋白含量，取各组总蛋白，每管中加入×5上样缓冲液6 μl，再加去离子水调整待测样本体积为30 μl，分别在80 V及120 V电压条件下行蛋白浓缩及分离。SDS-PAGE 80 min，恒流200 mA，冰上转膜3 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入单抗(稀释度1∶750)和β-actin单抗(稀释度1∶3000)，混悬转动2～3 h，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次20 min，加入二抗(稀释度1∶1000)，混悬转动2 h，TBST漂洗3次，每次20 min。ECL显影，暗室胶片曝光、洗片。凝胶定量软件Quantity One分析各条带灰度值，β-actin作为内参照计算各组蛋白相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1 mRNA 在腺瘤性息肉、LST 及大肠癌组织中的表达 在腺瘤性息肉、LST及大肠癌组织中TGF-β1 mRNA平均相对表达量分别为0.01519±0.000421、0.01723 ± 0.000385 和 0.01882 ±0.000450。结果显示，LST中TGF-β1 mRNA表达水平显著高于腺瘤性息肉，而明显低于大肠癌，差异有统计学意义(P 均 ＜0.01，见图1)。

2.2 TGF-β1蛋白在正常大肠黏膜、腺瘤性息肉、LST及大肠癌组织中的表达 TGF-β1在正常肠黏膜及腺瘤性息肉组织中几乎不表达，而在大肠癌组织表达量显著升高。LST组织中的TGF-β1蛋白表达量比正常肠黏膜及腺瘤性息肉升高(P均＜0.05)，但明显低于大肠癌组织(P ＜0.01，见图2、3)。

3 讨论

LST作为一种形态特殊的大肠肿瘤，与传统意义上的大肠腺瘤明显不同，得到了全球学者的广泛关注。但目前对于LST的研究仍主要集中在内镜下的诊断及治疗方面[5-6]，而对其可能具有的较为独特的发生、发展分子机制研究仍十分缺乏。国内学者姜泊等[5]研究发现，Wnt/β-catenin信号途径在LST发生发展过程中有明显活化现象，且可能与部分关键分子的磷酸化失活有关，揭示了LST比大肠腺瘤更具有恶变倾向的可能分子机制。

TGF-β1的生物学功能极其复杂，在多种组织细胞的增殖、分化、凋亡、血管生成、细胞间相互作用、免疫反应、间质形成以及组织损伤修复等过程中起着关键性作用。近年来的大量研究表明，TGF-β1与肿瘤关系密切，可能在其发生和发展过程中起着双重调节作用，即在癌变早期TGF-β1作为抑癌因子出现，而在肿瘤的进展过程中可通过自分泌和(或)旁分泌途径刺激肿瘤浸润转移[7]

本实验通过qRT-PCR及Western bloting法分别从基因及蛋白水平对LST组织中TGF-β1表达情况进行检测，同时与腺瘤性息肉、大肠癌进行比较，结果发现:TGF-β1 mRNA表达水平显著高于腺瘤性息肉，而明显低于大肠癌。TGF-β1蛋白在正常肠黏膜及腺瘤性息肉组织中几乎不表达，而在大肠癌组织表达量显著提高。LST中的TGF-β1蛋白表达量比正常肠黏膜及腺瘤性息肉升高，但明显低于大肠癌组织。上述结果从分子水平进一步解释了LST的特殊性，亦提示LST可能比普通腺瘤性息肉更具有恶变倾向。因此，TGF-β1有望成为预判LST恶变倾向的重要指标。

TGF-β1需要与其相应受体结合并通过Smads蛋白发挥具体生物学效应，因此有关TGF-β1在LST发生、发展过程中的具体作用机制仍需更进一步的研究。另外本课题样本数量有限，在一定程度上影响了结果的可靠性，今后仍需在扩大样本量基础上作更为深入的研究。

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