大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四联试纸条的检测效果评价

，，，，

(1.江苏省泰州市姜堰区动物卫生监督所，江苏泰州 225500； 2.北京勤邦生物技术有限公司)

牛奶中的抗生素含量会影响牛奶的进一步发酵加工，许多国家及联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)等国际机构都作出规定：奶牛在接受抗生素治疗期间及用药后数日内的乳汁不得用于生产商品乳[1,2]。尽管如此，仍有部分农场或奶农无视相关规定，向乳品加工企业提供含有抗生素的原奶。因此，对乳品加工企业来说，抗生素已成为原奶收购环节中必不可少的检测项目[3]。

大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四联胶体金快速检测试纸条，是以胶体金技术和免疫层析技术相结合生产的一种灵敏度高、检测时间短、准确度高、易贮存、携带方便、现场操作简便、可一次检测4种抗生素的快速检测产品，广泛应用于牛奶收购、流通、生产、销售等环节的牛奶中抗生素筛查，10 min内就可检测出结果。本试验对大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四联胶体金快速检测试纸条的检测限、特异性、重复性、假阳性率、假阴性率以及影响胶体金检测效果的主要因素等方面进行了评价。

1 试验材料

大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四联胶体金快速检测试纸条由北京某生物科技有限公司生产，批号H20120913B20。 牛奶样本 购自超市。大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素及其他抗生素标准品由sigma公司提供。

2 试验方法

2.1检测方法与结果判断 采用微量移液器吸取200 μL待检牛奶样品于冻存有胶体金标记抗体的微孔中，缓慢抽吸至牛奶充分与微孔中试剂混匀。将试纸条插入微孔中-印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。 室温(20～25 ℃)孵育5 min后，取出试纸条观察颜色，判定结果。

阴性(-)：C线显色，T线显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素浓度低于检测限。

阳性(+)：C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中大观霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限(详见图1)。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。

图1 试纸条检测结果判定

2.2最低检测限试验 将不同浓度的大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素标准品添加的牛奶样品分为5组，每组样品10份，其中大观霉素各组浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；庆大霉素各组浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；新霉素各组浓度分别为200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L；链霉素各组浓度分别为20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L。分别用试纸条检测，5 min后观察结果。

2.3特异性试验 将牛奶中常见的其他抗生素(青霉素G、头孢洛宁、四环素、红霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶)添加到阴性牛奶样品中，使其终浓度为500 μg/L，分别用试纸条重复检测5次，5 min后观察结果。

2.4重复性试验 分别用添加大观霉素20 μg/L、庆大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、链霉素80 μg/L标准品的阳性牛奶和阴性牛奶各1份，分别用试纸条进行重复检测20次，5 min后观察结果。

2.5不同温度检测 分别用添加大观霉素20 μg/L、庆大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、链霉素80 μg/L标准品的阳性和阴性牛奶各5份，分别在室温条件下(25℃)、培养箱(37℃)和冰箱(4℃)中用试纸条进行检测， 5 min后观察结果。

2.6不同湿度检测 分别用添加大观霉素20 μg/L、庆大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、链霉素80 μg/L标准品阳性牛奶和阴性牛奶各5份，分别在气候箱中相对湿度为30%～40%， 60%～70%，85%～90%时用试纸条检测，5 min后观察结果。

2.7假阳性率 随机用阴性牛奶样品50份，用试纸条检测，5 min后观察结果，以考察试纸条的假阳性率。

2.8假阴性率 随机用添加大观霉素20 μg/L、庆大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、链霉素80 μg/L标准品的阳性牛奶样品50 份，用试纸条检测，5 min后观察结果，以考查试纸条的假阴性率。

3 结果与分析

3.1试纸条最低检测限 牛奶中大观霉素含量<15 μg/L时，均出现阴性结果，≥20 μg/L时，均出现阳性结果，15 μg/L时，检测10份样品中有1份出现阳性结果，检出率为10%；庆大霉素含量<15 μg/L时，均出现阴性结果，≥20 μg/L时，均出现阳性结果，15 μg/L时，检测10份样品中有2份出现阳性结果，检出率为20%；新霉素含量≤400 μg/L时，均出现阴性结果，≥500 μg/L时，均出现阳性结果；链霉素含量≤60 μg/L时，均出现阴性结果，≥80 μg/L时，均出现阳性结果(详见表1)。为避免在实际应用中出现假阴性结果，给乳制品企业带来潜在威胁，在本试验条件下试纸条的最低检测限规定为：大观霉素20 μg/L；庆大霉素20 μg/L；新霉素500 μg/L；链霉素80 μg/L。

表1 不同浓度抗生素牛奶检测结果

3.2特异性试验 分别对添加500 μg/L青霉素G、头孢洛宁、四环素、红霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶的牛奶样品进行检测，检测线和质控线均显色，结果为阴性，所以试纸条特异性较好。

3.3重复性试验 阳性牛奶与阴性牛奶重复检测结果见表2。 结果显示，所检样品中，只有1份阴性牛奶样品在进行庆大霉素检测时出现阳性结果，总体阴性牛奶与阳性牛奶重复检测结果均一，表明该试纸条重复性较好。

表2 试纸条重复性检测

3.4温度影响 不同温度条件下的检测结果，详见表3。 结果表明，在25℃条件下进行检测，未出现假阳性或假阴性结果；在37℃或4℃，出现假阳性或假阴性结果，但影响并不显著。

表3 温度的影响试验

3.5湿度影响 不同湿度条件下的检测结果，详见表4。 结果表明，在相对湿度60%～70%条件下进行检测，未出现假阳性或假阴性结果；在相对湿度30%～40%和85～90%条件下检测，出现假阳性结果，尤其在相对湿度85%～90%时，影响显著。

表4 湿度的影响试验

3.6假阳性率试验 检测50份阴性牛奶，结果48份呈阴性，2份呈阳性，即假阳性率为4%。

3.7假阴性率试验 检测50份阳性牛奶，结果均呈阳性。

4 讨 论

经试验表明，环境温度对检测结果有一定影响，在普通实验室温度结果显示良好。主要是由于试纸条所需牛奶样品量很少，高温时牛奶中的水分容易蒸发，低温时牛奶中的水分流动性变差，从而影响检测结果，所以使用试纸条检测时推荐在室温(25℃)进行。50%～70%湿度条件下检测结果良好。

本试验中，试纸条没有出现假阴性，符合检验要求。由于牛奶检测的影响因素甚多，如采样时间，所留标本时间长短，提供标本者的饮食情况，以及检测时的环境条件，都将影响检测结果，尤其是牛奶样本成分复杂，特别是在含有所检抗生素结构相近的代谢物时，都将导致出现假阳性。由于试纸条主要用于筛选，可以允许一定的假阳性率，所以出现4%的假阳性率属可接受范围之内。

根据有关资料，经抗生素治疗的奶牛必须有最短2d，最长45d的休药期，休药期之后所产鲜奶方可出售或作为乳制品加工原料乳[4]。所以经抗生素治疗的奶牛，其所产牛奶在休药期内禁止在市场上出售或作为乳制品加工原料乳，由于利益驱使，仅仅依靠生产单位的自我约束力是不够的，收购单位在收购牛奶时应对牛奶中残留抗生素进行检测和监控[5,6]。

大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四联胶体金快速检测试纸条由于具有准确度高、检测时间短、携带方便、无需仪器和洗涤步骤等优点，因此大大地提高了检测效率，十分适合现场快速检测，作为一种快速筛查的手段可以有效地弥补广大基层单位因设备和经费问题而无法开展食品中大观霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素的检测和监控，具有重要的经济价值和社会价值。

[1]郁蓉,王岁楼.原料奶安全检测及质量控制的研究进展[J].乳业科学与技术，2009,32(6):289-293.

[2]张小勇.建立健全鲜奶质量管理体系[J].中国奶牛，2005(4):53-54.

[3]孙妮娜,秦向阳,杨宝祝,等.国内外农业标准化发展现状与分析[J].山东农业科学，2007(3):124-126.

[4]李洪忠,蔡生胜.鲜牛奶中抗生素残留的检测[J].China Cattle Science，2008，34(2):26-27.

[5]李文红,孙丽新.我国奶业质量安全情况分析[J].食品研究与开发，2006,27(1):175-178.

[6]白淑萍,阎爱莉,兰淑东,等.市售鲜牛奶中抗生素残留的检测及今后建议[J].丹东医药，2007(4):22-23.