原油水溶性成分对栉孔扇贝抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响*

王晓艳，冯丽娟，蒋凤华，郑 立，赵美丽，许振华

（1.国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心，山东 青岛266061；2.中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛266100；3.青岛科技大学化学与分子工程学院，山东 青岛266042）

随着海洋石油钻探开发及运输业等的发展，石油已经成为海洋常见的污染物之一。石油中所含的芳香烃及其衍生物，可使海洋生物中毒，高浓度污染甚至会引起海洋生物的死亡，对海洋生态系统造成极大的破坏［1］。因此，进行石油的海洋生态毒理学研究，对于石油的污染效应评价和海洋溢油生态损害评估具有重要意义。

石油等污染物进入水生生物体后，可通过自身或中间代谢产物的氧化还原反应产生大量活性氧自由基，如H2O2和O－2·。这些自由基如不被及时清除，会引起氧化应激，进而产生酶失活、DNA断裂和脂质过氧化等毒性效应。贝类体内的抗氧化防御系统如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）等在清除活性氧自由基、防止氧代谢物的损伤等方面具有重要作用，是机体的重要抗氧化酶［2］。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂质过氧化产物中的一类，它可使DNA、膜蛋白和酶等发生交联反应，增加膜的通透性，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，对机体造成损伤甚至死亡。因此，测定MDA的含量可反映生物体内脂质过氧化（Lipid peroxidation，LPO）的程度，从而间接反映细胞受损伤的程度［3］。

近年来，国内外开展了一些污染物对鱼类和双壳类等水生生物抗氧化酶系统和MDA含量影响的研究［4－11］，但原油水溶性成分（Water soluble fraction of crude oil，WSF）对栉孔扇贝抗氧化酶活性和 MDA含量影响的研究仍未见报道。

双壳贝类为滤食性底栖动物，分布范围广，生活方式固定，对其生活环境中的石油烃污染物有较强的生物蓄积作用。贻贝监测计划就是通过测定贝类体内污染物的残留量，对其周围海洋环境的污染程度和变化趋势进行监测和评价。作者以我国近岸海域重要经济贝类－栉孔扇贝为实验对象，初步研究了 WSF对扇贝血淋巴细胞DNA损伤［12］，而本文则研究不同浓度WSF对栉孔扇贝鳃和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量的影响。研究结果以期为石油污染对贝类影响的毒理学研究提供基础参数，并为溢油损害评估提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用栉孔扇贝（Chlamys farreri）购自青岛流清河养殖区，洗净后清除其体表附着物，用清洁海水暂养1周，每日投喂金藻1次，清除死贝，待其状态稳定后，选取活力好，体长4～5cm的个体进行实验。

1.2 仪器和试剂

主要仪器：立式超低温保存箱（青岛海尔DW－86L626），荧光分光光度计（日本 Hitachi FL－4500），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司KQ－400KDE），分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司 WFJ2000），恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂 HH·S21－8S），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司BS224S），低温高速离心机（德国Hermle公司Z383K）。

主要试剂：考马斯亮蓝G－250为美国Sanland公司分析纯产品，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 含WSF海水的制备及其浓度测量 实验用原油取自天津中海油平台，原油与海水按1∶10（V／V）混合，超声分散1h，静置4h后吸取水相即为母液，置于棕色玻璃瓶中4℃保存备用。母液中石油烃含量按照海洋监测规范方法［13］进行测量。

1.3.2 暴露实验和样品处理 依据国家海水水质标准，一、二类石油烃含量≤0.05mg·L－1，三类石油烃含量≤0.30mg·L－1，四类石油烃含量≤0.50mg·L－1［14］，结合青岛胶州湾海水和崂山近岸海水中石油烃的浓度分布［15－16］，选用体积为50cm×40cm×35cm的玻璃水槽，分别加入不同体积含WSF的海水，实验溶液总体积为30L，测量各组实际浓度分别为0.02、0.18、0.32和0.51mg·L－1。将栉孔扇贝随机分为4组，每组40只，充气泵24h充气，每日投喂100mL金藻（密度为1×106～2×106个·mL－1）1次，更换1／3体积相同浓度的实验溶液，以使WSF浓度保持相对稳定。实验期间水温保持18～20℃。

在暴露实验的第1、2、4、7和10天采样，10d后将实验溶液全部换为清洁海水进行为期4d的恢复实验。每次随机选取3只扇贝，仔细分离出鳃和消化盲囊，预冷（4℃）超纯水冲洗后用滤纸吸干水分，称重，装在铝箔折成的小袋中，－80℃保存。

将鳃和消化盲囊置于预冷（4℃）的磷酸盐缓冲液中（NaCl0.014mol·L－1，KCl0.003mol·L－1，Na2HPO4·12H2O0.01mol·L－1，KH2PO40.002mol·L－1，pH＝7.4），冰浴下匀浆（1∶9，w／v），然后立即离心（4℃，10 000×g·min－1，30min），取上清液用于酶活性测定。

1.3.3 毒理学指标的测定 使用SOD试剂盒、CAT试剂盒和MDA试剂盒，按照说明书进行操作。

SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，其定义为：每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位。

CAT活性采用钼酸铵显色法测定，其定义为：每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2的量为一个活力单位。

MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定。蛋白含量采用考马斯亮蓝方法进行测定。

1.4 数据的处理和分析

实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计处理。结果以平均值±标准偏差表示，用one way－ANOVA进行差异性显著分析，与对照组相比，0.01＜P＜0.05认为差异显著，P＜0.01认为差异极显著。

2 结果

2.1 不同暴露时间下WSF对栉孔扇贝鳃和消化盲囊SOD活性的影响

如图1（a）所示，实验期间对照组鳃中SOD活性的变化范围为59.60～77.39U／mg。0.18mg·L－1浓度组SOD活性随暴露时间延长而逐渐增加，前2天时SOD活性低于对照组，表明受到抑制；第4天后一直高于对照组，表明SOD活性被诱导。0.32mg·L－1浓度组SOD活性在实验期间内无显著变化，一直被抑制。0.51mg·L－1浓度组SOD活性在第1天时被极显著诱导，高出对照组39.04%；之后随着时间的延长SOD活性逐渐降低，且一直被极显著抑制。进一步分析表明，第2天时SOD活性与 WSF浓度存在很好的负相关性（n＝12，r＝0.991，P＜0.01），即随 WSF浓度增加SOD活性降低。4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组SOD活性被显著诱导，而0.32和0.51mg·L－1浓度组SOD活性则极显著低于对照组，抑制率分别为36.11%和53.45%。

由图1（b）可见，对照组消化盲囊中SOD活性的变化范围为25.57～38.86U／mg，显著低于对照组鳃的SOD活性（P＜0.01）。0.18mg·L－1浓度组SOD活性在第4和10天时与对照组相比无显著差异，其余时间均被显著诱导。0.32和0.51mg·L－1浓度组SOD活性表现出大致相同的变化趋势，均呈现峰值变化，第1天时与对照组相比无显著差异；随暴露时间延长SOD活性逐渐增加，分别在第7和4天达最大值，并一直被极显著诱导。进一步分析表明，第2～10天内SOD活性与WSF浓度均存在很好的正相关性（n＝12，r＝0.947～0.985，P＝0.015～0.053）。4d恢复实验后，3个实验组的SOD活性均处于被诱导状态（P＜0.01）。

2.2 不同暴露时间下 WSF对栉孔扇贝鳃和消化盲囊CAT活性的影响

图1 不同浓度WSF作用下栉孔扇贝的SOD活性变化Fig.1 Effects of WSF of crude oil on SOD activities of Chlamys farreri

如图2（a）所示，对照组鳃中CAT活性的变化范围为19.75～37.76U／mg。0.18mg·L－1浓度组CAT活性随暴露时间没有产生显著变化，实验期间一直被极显著诱导。除第7天外，0.32mg·L－1浓度组CAT活性在其余时间内一直被诱导。0.51mg·L－1浓度组CAT活性呈现峰值变化，第4天达到最大值，实验期间内一直被诱导（P＜0.01或0.01＜P＜0.05）。4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组CAT活性被显著诱导，0.32mg·L－1浓度组CAT活性恢复到对照组水平，而0.51mg·L－1浓度组CAT活性则极显著低于对照组，抑制率为63.67%。

由图2（b）可见，对照组消化盲囊中CAT活性的变化范围为8.07～12.77U／mg，显著低于对照组鳃的CAT活性（P＜0.01）。3个实验组的CAT活性表现出大致相同的变化趋势，第1天时CAT活性均被极显著诱导，且酶活性与WSF浓度存在很好的正相关性（n＝12，r＝0.980，0.01＜P＜0.05）；随暴露时间延长CAT活性逐渐降低，分别在第10、7和4天时开始被抑制，且第10天时酶活性与WSF浓度存在负相关性（n＝12，r＝0.941，P＝0.059）。4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组CAT活性被诱导，0.32mg·L－1浓度组CAT活性被抑制，但与对照组相比均无显著差异；0.51mg·L－1浓度组CAT活性极显著低于对照组，抑制率为47.20%。

图2 不同浓度WSF作用下栉孔扇贝的CAT活性变化Fig.2 Effects of WSF of crude oil on CAT activities of Chlamys farreri

2.3 不同暴露时间下 WSF对栉孔扇贝鳃和消化盲囊MDA含量的影响

如图3（a）所示，对照组鳃中 MDA含量在11.86～15.56nmol／mg范围内。第1天时，3个实验组MDA含量均低于对照组，且含量值与WSF浓度存在很好的负相关性（n＝12，r＝0.963，0.01＜P＜0.05）。第2天后0.18mg·L－1浓度组MDA含量一直高于对照组，且持续增加，表明损伤程度也逐渐增加。0.32mg·L－1浓度组MDA含量在第2天时显著低于对照组，第4天开始趋于稳定，并一直高于对照组。0.51mg·L－1浓度组MDA含量自第2天开始一直高于对照组，并于第4天达到最大值，高出对照组78.48% （P＜0.01）。进一步分析表明，第4天时MDA含量与WSF浓度存在很好的正相关性（n＝12，r＝0.998，P＜0.01）。4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组 MDA含量恢复到对照组水平，而0.32和0.51mg·L－1浓度组 MDA含量分别高出对照组23.54% （0.01＜P＜0.05）和45.86%（P＜0.01）。

图3 不同浓度WSF作用下栉孔扇贝的MDA含量变化Fig.3 Effects of WSF of crude oil on MDA contents of Chlamys farreri

由图3（b）可见，对照组消化盲囊中MDA含量的变化范围为205.19～236.86nmol／mg，极显著高于鳃（P＜0.01），表明消化盲囊受氧化胁迫程度较鳃严重。0.18mg·L－1浓度组MDA含量除在第2和4天时与对照组相比无显著差异之外，其余时间内均极显著低于对照组。0.32mg·L－1浓度组MDA含量在实验期间内无显著变化并一直高于对照组，且第1和10天时与对照组存在极显著差异。0.51mg·L－1浓度组MDA含量在第4天时显著低于对照组，其余时间极显著高于对照组。4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组MDA含量恢复到对照组水平，而0.32和0.51mg·L－1浓度组MDA含量分别高出对照组14.82% （P＜0.01）和20.63% （P ＜0.01）。

3 讨论

SOD、CAT和MDA是研究生物对各种污染胁迫效应中受到密切关注的生理指标。抗氧化酶（SOD、CAT）的作用是清除活性氧自由基，从而保护生物体；此外，酶活性的变化还可以间接反映出生物体内自由基含量的变化［17］。脂质过氧化是细胞受损伤的机制之一，MDA作为脂质过氧化指标，其含量的增加意味着细胞器和细胞结构与功能的破坏，进而可能导致组织器官的病变，发生疾病［18］。

研究发现，对照组消化盲囊中SOD、CAT活性均低于鳃，这与文献［8－9，19－20］中的报道不一致。其原因可能是鳃作为双壳类生物的呼吸器官和滤食器官与外界水体环境接触最广泛。由于消化盲囊中SOD和CAT活性低于鳃，因而导致前者MDA含量高于后者，这与部分文献报道一致［18，20－22］。张培玉等［20］认为抗氧化酶越敏感的器官，受损伤的程度则越严重，即抗氧化酶下降越大，膜脂质过氧化程度越严重。

对鳃和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量进行相关性分析，得出如下结果：鳃组织中SOD、CAT和MDA之间不存在显著相关性；对消化盲囊而言，第4和10天的MDA和CAT之间分别呈现显著的正相关性（r＝0.8561，n＝12，P＝0.014）和负相关性（r＝－0.8289，n＝12，P＝0.021），第14 天的 SOD 和MDA呈现显著的正相关性（r＝0.7663，n＝12，P＝0.045）。实验期间，SOD和CAT并未表现出同步性。王重刚等［23］、杨晓斌等［24］和赖廷和等［17］的研究中也有类似的现象产生，究其原因可能在于O－2·的歧化反应不是H2O2的唯一来源，后者也可通过氨基酸或细胞色素P450氧化酶的激活而获得［25］。

低浓度WSF暴露初期，鳃和消化盲囊中SOD和CAT活性均表现出代偿性增强，清除体内产生的过量活性氧自由基，从而保护细胞免受氧化损伤，表现为MDA含量低于对照组。但随着WSF浓度和暴露时间的增加，自由基不断积累，细胞受氧化损伤的程度不断加重，SOD和CAT清除能力逐渐趋于饱和，活性也逐渐降低。因而，0.51mg·L－1浓度组扇贝鳃和消化盲囊中 MDA含量均显著增加，这与Pan等［26］和王凡等［27］的研究结果相一致。研究表明石油的毒性作用机制主要是石油代谢中产生的自由基对免疫细胞如吞噬细胞的脂质过氧化作用，影响了双壳类的免疫功能［19］。

此外，实验过程中还可观察到0.32和0.51mg·L－1浓度处理下消化盲囊SOD活性一直被诱导，这可能是由于消化盲囊中包含肝脏，而肝脏被认为是生物体代谢解毒的主要器官［19］。

4d恢复实验后，0.18mg·L－1浓度组鳃和消化盲囊中 MDA含量均恢复到对照组水平，而0.32和0.51mg·L－1浓度组MDA含量仍高于对照组。表明实验条件下低浓度WSF对扇贝机体产生的损伤是可逆的，而高浓度WSF对扇贝机体的损伤不可逆，这与陈家长［10］的研究结果一致。

本文研究结果显示，特定时间内鳃和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量均与WSF浓度存在相关性，其中消化盲囊SOD活性与WSF浓度之间的相关性在较长时间内存在，表明消化盲囊中SOD活性较其它指标更可能作为监测石油污染的有效生物标志物。

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