肿柄菊粗提物对线虫毒杀活性的研究

张余杰，刘志华，张 亚，秦小萍，何金玲

（1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明650201；2.河南省濮阳县农业局，河南 濮阳457100；3.湖南农业大学生物安全科技学院，湖南 长沙410128）

肿柄菊（Tithonia diversifolia A.Gray），属于菊科肿柄菊属植物，又称金光菊、树菊，多年生半灌木状草木植物，根系发达，茎粗壮，繁殖力强，能在各类土壤中生长[1］。原产地为墨西哥及中美洲地区，现大量分布于热带和亚热带，在东南亚、南非、太平洋的一些国家和地区成为入侵田间、路边的杂草，逐渐扩散形成单一优势种群[2］。目前，肿柄菊在我国广东、广西、福建、云南等省有逃逸种群分布，尤其是环境适宜的云南省，已经给该地区的农业生产带来一定危害，同时对生物多样性造成了威胁，是一种具有较大潜在危害性的外来植物[3］。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是近些年来广泛应用于毒理学研究的经典模式动物[4，5］。秀丽隐杆线虫繁殖速度快，在土壤和水中都能生存，十分有利于短期药效试验。

菊科植物化学成分的复杂性和多样性均居植物界之首，潜在着大量的杀菌、杀虫活性成分，具有极高的研究价值和广阔的开发利用前景[6］。但国内外对肿柄菊的研究并不多，主要集中在除草和杀虫活性研究、药物开发、有机肥料的利用等方面。郝妮娜等[7］研究表明肿柄菊提取物对7种病原菌具有抑制作用。杨海艳等[8］报道了肿柄菊对蜈蚣蕨孢子萌发和假根生长的影响。王丽等[9］研究表明肿柄菊水提液对水田稗和玉米种子萌发具有显著的抑制作用。Jama等[10］报道肿柄菊作为绿肥不仅可以丰富作物营养物质来源，而且可以降低土壤中某些物质对磷元素的吸附并增加土壤微生物的量。Basamba等[11］研究表明肿柄菊可以显著提高贫瘠土壤的交换性钙、镁、钾等营养成分。Herrera等[12］从肿柄菊中分离出4种倍半萜烯内酯类化合物。Macias等[13］对肿柄菊的研究为开发新作用靶点的除草剂和杀虫剂提供了新思路。Adedire等[14］研究表明肿柄菊叶干粉乙醇提取物对四纹豆象有明显的杀卵、抗成虫羽化和杀虫作用，具有开发为昆虫杀虫剂的潜力。周鸿等[15］报道了肿柄菊3种成分：圆叶肿柄菊素A、圆叶肿柄菊素C和3，5－二氧－咖啡酰奎尼酸，其中咖啡酰奎尼酸有一定的抗菌活性[16］。Bordoloi等[17］研究表明肿柄菊含有的青蒿酸、青蒿素等可开发为天然的植物生长调节物质，亦可以作为天然除草剂合成的模型物。

目前，有关肿柄菊提取物对线虫的毒杀活性及其成分还缺乏研究，其毒杀线虫的机制更是鲜有报道。作者在此考察肿柄菊的不同有机溶剂粗提物的毒杀线虫活性（简称杀线活性），拟为研制高效低毒、绿色环保的新型杀线虫农药奠定基础。

1 实验

1.1 材料

肿柄菊（Tithonia diversifolia）采集于云南昆明跑马山区域。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）由云南农业大学植物保护学院农药系提供。用贝曼氏漏斗法分离出一定数量的线虫，采用离心机清洗纯化（1500r·min－1，5min）3次，加入适量蒸馏水，配制成每毫升含秀丽隐杆线虫约7条的悬液（混合虫龄），封口膜密封，备用。

1.2 试剂与仪器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇均为化学纯，丙酮为分析纯，实验用水为蒸馏水。

BCD－215YD型冰箱，青岛海尔股份有限公司；SHB－Ⅲ型真空泵、HH－S型水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；HS.Z68.10型蒸馏水器，北京中兴伟业仪器有限公司；SW－CJ－1FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SZM系列体视显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；R205B型旋转蒸发器，上海申生科技有限公司；FA2004型上皿电子天平，上海精科天平；8200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；FZ102型微型植物粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；RXZ型智能人工气候箱，宁波东南仪器有限公司；Finnpipette colour型单道移液器（20～200μL），芬兰雷勃集团；TopPette型单道移液器（100～1000μL），大龙兴创实验仪器有限公司；YXQ.SG46.280型手提式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗提物的制备

1.3.1.1 石油醚／乙酸乙酯粗提物的制备

将采集的肿柄菊枝叶在自然条件下晾1～2d，然后置于45℃恒温干燥箱中烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎后过40目筛。称取一定量粉末放入三角瓶中，加入石油醚／乙酸乙酯浸泡24h，然后置于超声波清洗器中振荡30min。最后用滤纸过滤，所得滤液用旋转蒸发器减压浓缩蒸干，即得到石油醚／乙酸乙酯粗提物，密封置于冰箱中冷藏，备用。

1.3.1.2 二氯甲烷粗提物的制备

将采集的肿柄菊枝叶在自然条件下晾1～2d，然后置于45℃恒温干燥箱中烘干至恒重，收集干枝叶600g，分装于3个三角瓶中，然后加入适量二氯甲烷浸泡24h。所得浸泡液用滤纸过滤，滤液用旋转蒸发器减压浓缩蒸干。将所得黄色提取物重新溶解在甲醇－水（7∶3）中，室温下过夜，弃沉淀，所得上清液再次用石油醚（沸点40～60℃）萃取，蒸干，即得到二氯甲烷粗提物，密封置于冰箱中冷藏，备用。

1.3.2 毒杀线虫实验

采用药液浸渍法[18］。用分析天平准确称取一定量的粗提物，先加入一定量的丙酮（体积分数不超过5%）溶解，再加入适量蒸馏水，分别配制成10mg·mL－1、20mg·mL－1、40mg·mL－1共3个质量浓度的药液，封口膜封好，备用。取直径6cm小玻璃培养皿若干，分别加入摇匀的线虫悬液7mL，再加入3mL不同质量浓度的药液，每个处理做4组平行实验。以丙酮溶液（丙酮＋蒸馏水）作为对照，丙酮的浓度与药液中的丙酮浓度相同。最后将培养皿置于5℃、RH60%黑暗的培养箱中培养，分别于24h、48h、72h用体视显微镜观察3次，用针刺法确定线虫死亡与否，记录每次线虫死亡的条数。

1.4 统计分析

各处理组的死亡率、校正死亡率按下式计算：

按文献方法[19］将杀线活性分为五级：

“－”：表示校正死亡率≤10%，无杀线活性；

“＋”：表示校正死亡率为10%～30%，杀线活性弱；

“＋ ＋”：表示校正死亡率为30%～50%，杀线活性中等；

“＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率为50%～80%，杀线活性较强；

“＋ ＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率＞80%，杀线活性强。

2 结果与讨论

2.1 肿柄菊不同粗提物的杀线活性（表1 ）

由表1 可知，乙酸乙酯和石油醚粗提物的杀线活性随其浓度的增大逐渐提高，但二氯甲烷粗提物例外，其杀线活性在中等浓度时较高。浓度为10mg·mL－1时，3种粗提物均无杀线活性；浓度为20mg·mL－1时，杀线活性大小依次为二氯甲烷粗提物＞石油醚粗提物＞乙酸乙酯粗提物，二氯甲烷粗提物处理72h后，线虫校正死亡率达到50.6%，而石油醚和乙酸乙酯粗提物处理72h后的线虫校正死亡率分别为42.9%、33.3%；浓度为40mg·mL－1时，乙酸乙酯和石油醚粗提物处理48h后的杀线虫效果已较好，处理72h后线虫校正死亡率分别达到73.6%、70.8%，而二氯甲烷粗提物杀线活性较弱。总体而言，乙酸乙酯和石油醚粗提物的杀线活性较好。

表1 肿柄菊不同粗提物的杀线活性Tab.1 Poisonous activity on Caenorhabditis elegans of different Tithonia diversifolia crude extracts

2.2 讨论

目前，化学药剂仍是防治线虫的主要手段，比较常用的杀线虫剂为溴甲烷、克百威、噻唑磷等，存在持效长、污染严重等问题，与现代社会环保节约的发展理念相悖。随着人类环保意识的加强，化学药剂将会逐渐停止使用，研究、开发新型高效杀线虫剂是线虫防治发展的趋势。20世纪80年代，许多国家开始了植物源杀线虫剂的研究，其中美国、英国和印度对此方面研究较多，确定了很多植物活性成分的杀线活性，取得了较大的进展[20，21］。截止2009年，已经报道具有杀线活性的植物约有100多种、40多科，其中具有杀线活性的天然化合物也达到10多类100多个[22，23］。

对肿柄菊3种不同有机溶剂粗提物的杀线活性分析表明，乙酸乙酯和石油醚粗提物杀线虫效果较好，在生物防治线虫方面具有广阔的开发前景。本研究结果与龙鼎新等[24］开发的化学药剂对松材线虫的活性结果相比，存在一定差距，主要原因可能是：（1）本研究所使用的粗提物中有效杀线虫活性成分的含量不高，分离纯化后其杀线虫效果可能会大大提高；（2）秀丽隐杆线虫和松材线虫虽然同属于线形动物门线虫纲，但在生理特性、生活习性等方面存在一些差异，一定程度上影响了实验结果；（3）实验过程中人为因素的影响。但本研究结果与禁用的剧毒农药甲胺磷相比，杀线虫效果差异较小。翁群芳等[25］的研究也表明肿柄菊粗提物对松材线虫的毒杀效果较好。

本研究只是对肿柄菊地上部分的粗提物进行了杀线活性研究，没有进行盆栽试验，未能深入研究有效杀线虫活性成分在枝叶中含量的高低，也未对粗提物中有效成分进行分离和鉴定，这些将是下一步研究的重点和方向。

3 结论

肿柄菊不同溶剂的粗提物具有较好的毒杀线虫活性，当浓度为10mg·mL－1时，石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷粗提物24～72h内对线虫的毒杀效果较弱；当浓度为20mg·mL－1时，二氯甲烷粗提物毒杀线虫活性最好，处理72h的线虫校正死亡率可达50.6%，乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物毒杀线虫活性均较弱；当浓度为40mg·mL－1时，毒杀线虫活性大小依次是乙酸乙酯粗提物＞石油醚粗提物＞二氯甲烷粗提物，其中乙酸乙酯粗提物处理72h的线虫校正死亡率达73.6%。未来应结合多种技术手段，将不同溶剂粗提物中的活性物质进行分离、纯化，有望开发出高效低毒、绿色环保的新型杀线虫农药。

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