苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

李海涛，曲步云，赵世源，贾宏博，高继国

(东北农业大学生命科学学院，中国哈尔滨 150030)

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是革兰氏阳性菌，芽胞杆菌属的一个种［1］.它形成芽胞的过程中，形成一个或多个伴胞晶体(parasporal crystal).大多数这种伴胞晶体具有杀虫活性，所以又称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或δ-内毒素(δ-endotoxin).Bt蛋白杀虫活性对非靶标生物无害，因此被制成生物杀虫剂广泛地应用于农业、林业以及卫生害虫的防治［2-3］.

cry7类基因编码蛋白相对分子质量大约为130 000，形成菱形晶体［4］.cry7类基因对鳞翅目、鞘翅目和直翅目害虫的生物防治方面有着广阔的前景，目前只报道了5种cry7类模式基因，cry7Aa、cry7Ab、cry7Ba、cry7Ca 和 cry7Da(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt.).其中 cry7Aa 杀马铃薯甲虫(LC50 为13.1 mg·L-1)［5］，cry7Ba1 杀小菜蛾(3 天 LC50 为95.7 μg·L-1，5 天 LC50 为39.9 μg·L-1)［6］，cry7Ca1 杀蝗虫(48 h LC50 为4.73 mg·L-1，72 h LC50 为 3.19 mg·L-1)［7］.目前已经发现了 8 个 cry7Ab类基因，但只有邓淑等报道了cry7Ab4对鞘翅目叶甲科的大猿叶甲有一定的杀虫活性，而对甜菜夜蛾、小菜蛾无明显杀虫活性［8］.鉴于cry7类基因有一定的研究价值，因此发掘新型cry7类基因，深入研究cry7类基因具有一定的实际意义［9］.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 本文所用菌株和质粒见表1.

表1 菌株与质粒Tab.1 The strains and the plasmids

1.1.2 培养基 液体LB，固体LB，液体1/2LB，固体1/2LB.

1.1.3 试剂 限制性内切酶及连接酶、pfu购自GiBcol、TaKaRa公司.dNTP、Taq酶等购自生工生物工程公司.分析纯化学试剂均为市售.

1.1.4 试虫 暗黑鳃金龟幼虫(一龄，8～10 d)，由中国农科院植保所和沧州植物保护研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 cry7基因的鉴定与克隆 采用cry7类基因型的通用引物对本实验室分离得到的22株野生菌进行了PCR鉴定，通过K5un7/K3un7筛选挑取阳性克隆进行酶切分析和核苷酸序列测定［10］.获取cry7类基因，将扩增目的片段连接PMD18-T载体，并进行测序.

1.2.2 cry7Ab全长基因的克隆 利用Bt已公布的cry7Ab类基因的全长序列，设计出用于扩增全长序列的引物，其中在5'端引物加进Bam H1酶切点，3'端引物加进SalⅠ酶切点，序列如下:

Q5UN7:5'-CGCGGATCCATGAATTTAAATAATTTAGGT-3'

Q3UN7:5'-ACGCGTCGACACATAGCTCTTCCATCAAAA-3'

用引物扩增得到cry7Ab 3.4 kb的全长基因，利用抗性筛选、PCR鉴定及酶切分析，筛选出含cry7Ab基因的阳性转化子［10-11］.

1.2.3 cry7Ab9基因的原核表达及杀虫蛋白质的提取 将鉴定得到的重组质粒pEB-cry7Ab转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并进行阳性菌株筛选，同时利用IPTG诱导表达，收集诱导物离心弃上清，进行SDS-PAGE电泳进行检测.将获得的阳性菌株，诱导表达.利用10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)悬浮，超声波破碎菌体，收集上清，确定蛋白质浓度.

1.2.4 杀虫活性测定

将待测样品稀释成不同梯度，取适量干土豆丝加入待测样品稀释液浸泡再称取100 g试验用土混匀，分装入经消毒的6孔培养板中.然后每空接入暗黑鳃金龟幼虫一头，每个浓度梯度重复5次，放置25℃光照培养箱中，分别于7 d及两周调查死、活虫数.以10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)溶液作为对照，试验方法同上.

2 结果与分析

2.1 Bt QZG121菌株伴孢晶体形态的观察

Bt菌株QZG121在1/2LB培养基上培养48 h后，形成单菌落，菌落乳白色，圆形或近圆形，36 h左右可观察到晶体.挑取单菌落少量，制片，油镜下观察，可见伴胞晶体形态为菱形，见图1.

2.2 cry7基因的鉴定与克隆

对本实验室保存的22株野生菌利用K5un7/K3un7进行了cry7基因鉴定，发现一株含有1.3 kb左右片段的菌株QZG121.利用PMD18-T载体，筛选挑取阳性克隆，并对阳性克隆PMD18-T载体进行酶切分析及核苷酸序列测定.测序结果利用NCBI blast比对分析，确定核苷酸序列与cry7Ab最为相似，相似度最高达到96%.酶切鉴定结果见图2.

图1 Bt QZG121菌株的晶体形态特点Fig.1 The crystal form of Bt QZG121

图2 基因的酶切与PCR鉴定分析Fig.2 Cry7Ab gene restriction and PCR analysis

2.3 cry7Ab全长基因的克隆

2.3.1 pEB-cry7Ab载体的构建 利用全长引物，进行全长基因的克隆表达，阳性转化子酶切分析及PCR鉴定结果，可以得到大小为5.7 kb的载体片段和3.4 kb cry7Ab基因片段，该cry7Ab全长基因表达载体构建正确.

2.3.2 cry7Ab全长序列及同源性分析 将获得的重组质粒pEB-cry7Ab测序，由DNA序列推导的氨基酸序列结果.cry7Ab蛋白由1 138个氨基酸组成，相对分子质量为129 437.其中亮氨酸Leu(L)、天冬酰胺Asn(N)、丝氨酸Ser(S)、异亮氨酸Ile(I)、谷氨酸Glu(E)较多，分别为 8.79%、7.38%、7.38%、7.12%、7.02%.该蛋白等电点 pH 5.045，为弱酸性蛋白［12］.

该基因在 GenBank登记，其 Accession number为GU936713.并由Bacillus thuringiensis命名委员会命名为cry7Ab9，NCBI Blast比对该基因蛋白序列与cry7Ab6最相似(见表2)，同源性为98.25%.

通过NCBI Conserved Domain分析结果表明该蛋白的DomainⅠ在氨基端第59～280位，由221氨基酸组成;DomainⅡ在第286～487位，合计201个氨基酸;DomainⅢ在第497～637位，共140个氨基酸组成.因此，Cry7Ab9蛋白质的生物杀虫活性区估计在氨基端59～637.用ANRHWETORV5.0软件对cry7Ab9进行蛋白质二级结构预测［13-14］，结果表明，在其蛋白质二级结构中，40%为 α-螺旋，29%为 β-片层，无 β-转角，31%为无规则线圈.

图3 pEB-cry7Ab的酶切与PCR鉴定分析Fig.3 pEB-cry7Ab restriction and PCR detection analysis

表2 Cry7Ab9与其他cry7Ab氨基酸的差异Tab.2 Difference of amino acid sequence between cry7Ab9 and other cry7Ab

2.4 Cry7Ab9 基因在 E.coli BL21(DE3)中的表达

利用pEB-cry7Ab9阳性质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达.如图4所示电泳条带2在相对分子质量为130 000处有高效表达.结果表明，cry7Ab9基因能在大肠杆菌中高效表达相对分子质量为130 000的蛋白.

2.5 暗黑鳃金龟幼虫生测结果及数据分析处理

用大肠杆菌表达蛋白pEB-7Ab9进行蛴螬生物测定.生测为每个梯度3个重复，每个重复10头虫共30头虫，如表3所示.7天校正死亡率 10 mg·L-1为11.11%、100 mg·L-1为 25.93%;两周校正死亡率 10 mg·L-1为 33.33%、100 mg·L-1为 48.15%.计算LC50 为289.99 mg·L-1.结果表明，cry7Ab9 蛋白对暗黑鳃金龟幼虫显示了一定的杀虫活性.

图4 Cry7Ab9在BL21(DE3)中的表达Fig.4 The cry7Ab9 protein expressed in BL21(DE3)

表3 暗黑鳃金龟幼虫生测结果Tab.3 The result of bioassay for Holotrichia parallela

3 讨论

本研究从千山分离得到22株苏云金芽胞杆菌中鉴定得到2株含有cry7基因型的菌株，检出率为9.09%.应用PCR法鉴定出其中一株Bt菌株QZG121中含有cry7Ab基因，并成功克隆到1个新的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry7Ab9.通过构建原核表达载体，获得阳性重组质粒pEB-cry7Ab，转入E.coli BL21(DE3)，cry7Ab9基因在E.coli BL21(DE3)中能正常表达.SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的相对分子质量为130 000.目前只报道了5种cry7类模式基因，其中cry7Aa对马铃薯甲虫有杀虫活性，cry7Ba1对小菜蛾有杀虫活性，cry7Ca1对蝗虫有杀虫活性.它对鳞翅目、鞘翅目和直翅目害虫均具有较高杀虫活性，故cry7类基因存在巨大的挖掘潜力，在生物防治方面有着广阔的前景.本研究发现的cry7Ab9基因与已知的cry7Ab6基因相似性高达98.25%.目前已知的8种cry7Ab类基因，只有邓淑等报道cry7Ab4表达蛋白质对鞘翅目害虫有杀虫活性［8］.本研究发现的cry7Ab9基因表达蛋白对暗黑鳃金龟幼虫进行初步生测，表现出一定杀虫活性.cry7Ab9新基因的发现不仅丰富了cry7类基因的种类，而且可以为鳞翅目、鞘翅目和双翅目害虫的防治以及抗性治理提供新的途径，也为研究蛋白质结构和功能的关系提供实验材料，特别是对鞘翅目类害虫的生物防治提供了新的基因资源.cry7Ab9基因与已知的cry7Ab6基因的相似性极高，但cry7Ab6基因并未表现出对鞘翅目的杀虫活性，这种相似性极高的同类基因所表现的活性差异，可以从生物信息学角度探索Bt杀虫晶体蛋白杀虫谱窄的解决方法，以期拓宽杀虫谱，提高Bt杀虫晶体蛋白在生物防治方面的利用价值.

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