高温产生物表面活性剂菌种的筛选及性能评价

李彩风，高光军，张绍东，吴晓玲，汪卫东

(胜利油田分公司a.采油工艺研究院，b.科技处，中国 东营 257000)

微生物提高原油采收率技术是一项利用微生物自身的有益活动及其代谢产物来提高原油采收率的技术［1-2］.微生物的代谢产物有多种，其中生物表面活性剂产物是集亲水基和憎水基结构于一身的两亲化合物，可降低水溶液和烃混合物的表面张力及界面张力，促进原油的乳化和分散［3-4］.与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有选择性好、用量少、无毒、能够被生物降解、不会对环境造成污染、可用微生物引入化学方法难以合成的新化学基团等优点，因而在提高原油采收率方面可以起到重要的作用［5-6］.产出表面活性剂的菌种有较多筛选方法［7-9］，应用快速、有效而直接的检测手段将使大量菌种的筛选工作取得事半功倍的效果.笔者尝试利用一种新的原油平板涂布方法，从多种来源的油田样品中选育出了一株高效产糖脂类生物表面活性剂且能以原油为唯一碳源的耐高温高压的菌种.该发现对在高温高压的极端油藏环境下实施微生物采油技术具有重要意义.

1 实验

1.1 菌种来源

筛选分离自胜利油田的油井产出液、石化炼厂污水及原油污染土壤等样品.

1.2 培养基

无机盐培养基:NH4Cl 1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，FeSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5 g，CaCl20.2 g，蒸馏水 1 000 mL，调整pH 值至7.2～7.4，添加2 g/L的原油作为唯一碳源，121℃灭菌20 min.

LB 培养基:胰蛋白胨 10 g，酵母浸出粉 5 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1 000 mL，调整 pH 值至7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min.

原油平板:NH4NO30.15 g，KH2PO40.1 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.02 g，CaCl20.02 g，NaCl 0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20 min，取出倒平板，待平板凝固后，加入少量灭菌原油，用涂布棒涂布均匀即可.

1.3 筛选方法

1.3.1 以原油为唯一碳源菌株的富集分离 将样品接入无机盐培养基中，分别于60℃、150 r/min下振荡培养.每隔7 d以5%的富集液接种至新鲜的原油液体培养基中.连续转接3次后将富集液进行梯度稀释并涂布于LB平板，60℃恒温培养，挑取单菌落保存备用.

1.3.2 高温产表面活性剂菌株初筛 将分离得到的高温菌株接种于原油平板中，然后于60℃下恒温培养2 d后，观察扩油圈大小.只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用原油形成扩油圈，故挑选有扩油圈的菌落作进一步研究.

1.3.3 高温产表面活性剂菌株复筛 将上述分离得到的高温菌株接到以原油为唯一碳源的无机盐培养基中，60℃，160 r/min下振荡培养7 d，然后取菌液进行表面张力的测定.

1.4 菌株性质评价

1.4.1 与原油相互作用 将筛选到的高温产表面活性剂菌株接种于LB斜面上培养7 d，用无菌水制成菌悬液，然后接种于原油液体培养基中，置于60℃、160 r/min的摇床培养2 d，离心收集油相.用数字粘度计测量原油的粘度;用玻璃套管法测凝固点.

1.4.2 高温、高压实验 将上述筛选得到的产生物表面活性剂的高温菌接种于原油平板上，然后置于压力容器中，充入气体至压力10 MPa(VO2∶VN2=0.2∶9.8)、60℃下恒温培养3 d后，观察扩油圈大小.

1.4.3 红外光谱分析 压片法:将1～2 mg生物表面活性剂的提取产品与200 mg纯KBr研细均匀，置于模具中，用(5～10)×107Pa压力在油压机上压成透明薄片，即可用于测定.试样和KBr都应经干燥处理，研磨到粒度小于2 μm，以免散射光影响，然后进行红外光谱的测定.

1.4.4 菌株分子生物学鉴定 将筛选得到的高温菌株进行基因组DNA的提取后，利用细菌16S rDNA基因通用引物:P11:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(对应于 E.coli 8～27)和 P12:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(对应于E.coli 1 492～1 510)来扩增16S rDNA基因序列.引物由大连宝生物工程公司合成.100 μL PCR反应体系，反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸10 min.扩增产物经电泳检测后测序.序列在GenBank中用BLASTN比较.

1.5 物理模拟驱油实验

采用具有不同渗透率的双管岩芯模型模拟中一区Ng3区块聚合物驱油后微生物驱油的情况.实验步骤:装填岩心→岩心抽真空，加中一区Ng3区块地层水至饱和→测孔隙度和渗透率参数→加油至饱和并计算原始含油饱和度→1次水驱至岩心产出液含水96%→注入聚合物0.3 PV，后续水驱至出口含水96%时→注营养体系(或营养体系+菌液)60℃培养一段时间→3次水驱至实验结束.

2 结果与讨论

2.1 菌株的富集分离结果

从样品中富集分离出16株能够在60℃条件下以原油为唯一碳源生长的菌株，有9株细菌的表面张力在40 mN·m－1以下.其中，菌株CH2的表面张力最低为35.6 mN·m－1.具体结果如表1所示.

表1 以原油为唯一碳源菌株的表面张力情况Tab.1 The surface tension of the strains utilizing oil as only carbon source

将上述分离得到的16株高温菌接种于原油平板，60℃下恒温培养2 d后，其情况如下图1所示，其中菌株Ⅲ、CH2、ZJ-3、WJ-6-1、WF-B、1-2及ZJ-5能产生明显的扩油圈，表明这7株细菌高温下生长代谢，产生了生物表面活性剂，将原油从平板剥开.

2.2 高温高压实验

将上述这7株明显产出生物表面活性剂的高温菌进行高压、高温下产生表面活性剂实验，产生扩油圈的情况如图2所示.从中可以清楚地看到菌株CH2产生的扩油圈直径最大.由此，可以定性判断CH2产生表面活性剂的能力相对最强，与上述菌液表面张力测定结果相一致.

图1 常压高温下以原油为唯一碳源菌株的扩油圈Fig.1 The extending oil ring of the strains under the constant pressure and high temperature of oil as only carbon source

图2 高压高温下以原油为唯一碳源菌株的扩油圈Fig.2 The extending oil ring of the strains under the high pressure and high temperature of oil as only carbon source

2.3 菌株CH2对原油性质影响

测试了菌株CH2对原油的降粘、降蜡和降凝作用，结果如表2所示.

表2 CH2对原油的降粘、降蜡和降凝效果Tab.2 The effects of CH2 on viscosity，wax content and solidifying point of oil

从表2可以看出菌株CH2作用后的原油粘度由实验前的1 080 mPa·s降低至556 mPa·s，原油降粘率达48.5%;菌株作用后的原油蜡含量也发生了显著降低，降低率为12.6%;凝固点由实验前的15℃降低至12℃.

2.4 红外光谱分析

提取菌株CH2发酵产生的生物表面活性物质进行红外光谱分析.如图3所示，3 440～3 300 cm－1的强吸收峰为O—H的伸缩振动吸收峰;2 980～2 850 cm－1和1 400～1 200 cm－1是C—H的伸缩振动峰;1 900～1 600 cm－1之间的吸收峰是 ==C O的伸缩振动引起的.这几组是糖类的特征吸收峰.判断该菌株产生的生物表面活性剂为糖脂类生物表面活性剂.

图3 CH2菌株产生的生物表面活性剂红外吸收光谱图Fig.3 IR spectrum of the biosurfactant from strain CH2

2.5 菌株鉴定

登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov，将测序结果用BLSAT与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比较，比对结果如表3所示.菌株CH2鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus).

表3 菌株16S rDNA序列BLAST结果Tab.3 BLAST of the strain＇s 16S rDNA sequence

3 物理模拟驱油效果

双管模拟岩芯的参数及一次注入水的驱油效率和注入聚合物的驱油效率情况见表4，采用合注分采的驱替方式进行.

表4 岩芯参数及一次水驱和注入聚合物驱油效率Tab.4 Core parameter and the oil recovery efficiency of once water flooding and polymer flooding

各岩芯在聚合物驱油后注入CH2菌液在60℃下进行培养，然后进行3次水驱，驱油效率见表5.结果显示外源菌株提高原油采收率明显，其中空白岩芯仅提高原油采收率0.3%，而注入菌液的岩心培养10 d和21 d后分别提高原油采收率4.7%和8.6%.

表5 聚合物驱油后微生物驱油效率Tab.5 The efficiency of microbial enhanced oil recovery after the polymer flooding

4 结论

目前，大部分产出生物表面活性剂微生物的要求温度为30～37℃［10］，以原油为唯一碳源且在高温(60℃以上)条件下产出表面活性剂微生物的研究报道较少.夏文杰［11］等从大庆油田地层水中分离得到一株地芽胞杆菌，能以原油为唯一碳源高温下生长并合成生物表面活性剂，发酵液表面张力可降低至29.58 mN·m－1，表面活性较强，但是没有研究高压对菌株产出生物表面活性剂的影响.Zheng Cheng-gang等以原油为唯一碳源60℃条件下从甘肃玉门油田分离到2株乳化能力较强的菌株，其中发酵液表面张力均在40 mN·m－1以上［12］.

本实验通过富集分离得到16株能在60℃高温环境下以原油为唯一碳源生长的菌株.通过原油平板产扩油圈实验筛选得到1株能在高温(60℃)、高压(10 MPa)复合极端条件下高效产出表面活性剂且以原油为唯一碳源生长的菌株CH2，表面张力可降低至35.6 mN·m－1.原油作用实验发现经菌株CH2作用后，原油物性得到改善.模拟高温聚合物驱油后油藏物模驱油实验，结果显示注入菌液CH2后培养21 d后提高原油采收率8.6%.以上发现对于该菌株在高温、高压的实际油藏环境下开展微生物采油具有重要意义.

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