和胃宝通过COX-2通路减轻氧化应激防治小鼠实验性胃溃疡的机制研究*

孙学刚，莫洁虹，2，刁建新，刘远亮，朱成全

(1.南方医科大学中医药学院，广州 510515;2.新会人民医院，广东江门 529100;3.解放军421医院，广州 510308)

和胃宝是临床用于防治消化性溃疡的有效验方［1］。前期的研究表明，和胃宝能够改善消化性溃疡上腹痛、腹胀等临床症状，并显著增加病人的溃疡愈合率和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)清除率［2，3］。Hp是导致消化性溃疡的重要病因，Hp的持续感染易引起胃黏膜局部的炎症反应，对白细胞的氧化爆发有明显的激发作用，并产生活性氧自由基［4］，而和胃宝能否通过改善溃疡炎症及氧化应激的作用尚不清楚。本研究拟研究和胃宝对实验性溃疡模型环氧合酶(cyclooxygenase-2，COX-2)和诱导性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)及氧化应激反应的作用，初步阐明和胃宝防治消化性溃疡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性BARB/c小鼠60只，体质量22～24g，随机数字法分为对照组、模型组、和胃宝低、中、高剂量组和法莫替丁组，每组10只，由南方医科大学实验动物中心提供(许可证号 SCXK粤2006-0015)。

1.2 药物

和胃宝主要由苦参、白芍、木瓜、乌贼骨、白及、大黄、金银花、甘草组成，由中国人民解放军第421医院提供，水煎浓缩成2g生药/ml，200目滤膜过滤除滓。法莫替丁胶囊为上海达华药业有限公司产品(批号100226)。主要试剂:iNOS一抗(sc-7271)、COX-2一抗(sc-23983)均购于美国Santa Cruz公司;血清幽门螺杆菌尿素酶抗体检测(胶体金法)试剂盒购自北京康美医药科技有限公司;免疫组织化学试剂盒购于基因公司;总蛋白提取及定量试剂盒购于碧云天试剂有限公司;ECL发光液购于 Merck Millipore公司。

1.3 主要仪器

主要仪器:德国莱卡石蜡切片机;日本尼康Eoipse Ti-s荧光倒置显微镜及分析软件;美国Thermo全波段酶标仪;瑞典MiniVE垂直蛋白电泳转印系统;美国柯达2000MM全光谱多功能图像工作站。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立 Hp(NCTC 11637)1.4×109CFU感染 BARB/c小鼠，连续5次接种，1周完成［5］。感染Hp的小鼠禁食不禁水24 h后，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开腹暴露胃，在胃前壁窦体交界同一部位(避开血管)，用浸有100%冰醋酸、直径为5mm的圆形滤纸接触1 min，然后还纳胃体逐层缝合切口。

1.4.2 分组与喂药 小鼠随机分组后称重、标记。于造模后1d分别给予和胃宝高剂量3g/(kg·d)、中剂量2g/(kg·d)、低剂量1g/(kg·d)，法莫替丁10 mg/(kg·d)和等体积的0.9%生理盐水灌胃，每日1次，连续10 d。处死前1d禁食不禁水，麻醉后剖腹，腹主动脉取血;结扎贲门，摘取全胃，胃组织分别置于10%的甲醛和－80℃备用。

1.5 观察内容及方法

1.5.1 组织学检查 甲醛固定组织常规脱水、石蜡包埋、4μm切片，苏木精-伊红染色。显微镜(Nikon Eoipse Ti-s)下随机选取5个视野，观察炎症细胞浸润、黏膜层厚度及纤维排列。

1.5.2 抗幽门螺杆菌抗体 胶体金法测得血清中Hp抗体表达水平，按颜色反应判定结果:无颜色为阴性(0级)，浅黄色至橘红色为阳性，按深浅分为+(1级)++(2级)。

1.5.3 免疫组化检查 切片脱蜡、水化、柠檬酸钠抗原修复、内源性封闭、外源性封闭后，滴加iNOS、COX-2一抗孵育，加二抗和生物素，DAB显色，苏木精复染，每张切片随机选取3个视野观察并拍照。蛋白表达依据染色水平分为0(无)、1(轻度)、2(中度)和3(重度)，依据染色面积0(无)、1(≤25%)、2(＞25%≤50%)和3(＞50%)，二者相乘得到该视野表达水平。

1.5.4 蛋白质免疫印迹 每组取胃组织样本50mg，提取总蛋白。每样本取50 ug行SDS凝胶电泳，转印至硝酸纤维膜上(Pall公司)，5%脱脂牛奶封闭，室温孵育1.5 h;分别加入COX-2抗体和iNOS抗体，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，用ECL化学发光法在Kodak 2000MM图像工作站成像。COX-2、iNOS的相对表达水平为二者的光密度值与β-actin光密度值的比值。

1.6 统计学方法

应用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用均数±标准差(±s)表示，首先应对数据进行方差齐性检验，方差齐时应用ANOVA法进行检验，并用LSD法进行组间两两比较;方差不齐时应用Welch法进行检验，应用Games-Howell法进行两两比较;等级资料进行k个多元独立样本的非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 和胃宝对实验性胃溃疡小鼠一般情况和组织病理学的影响

模型组小鼠术后食欲下降、活动减少、四肢无力、倦卧嗜睡、被毛蓬松，和胃宝低中高剂量组显著改善其倦怠嗜卧表现，中高剂量组显著增加进食量。图1显示，模型组小鼠均可见溃疡形成，黏膜上皮损坏、脱落严重，见大量炎症细胞浸润，溃疡床有肉芽组织形成，溃疡周围黏膜腺体呈囊状扩张，顶端向溃疡底部倾斜，纤维排列紊乱。与模型组比较，和胃宝高、中剂量组显著改善溃疡损伤，表现为溃疡较为表浅，黏膜层较厚，炎症细胞浸润减少，纤维排列较整齐，其中高剂量组和法莫替丁组改变较为显著。

图1 和胃宝对实验性胃溃疡小鼠组织病理学的影响

2.2 和胃宝对胃溃疡小鼠SOD、MDA和Hp抗体水平的影响

表1显示，模型组SOD活性显著降低，与模型组比较，和胃宝中、高剂量组显著提高SOD的活性(P＜0.05，P＜0.01)。模型组MDA含量降低，与模型组比较，和胃宝高剂量组和法莫替丁降低MDA水平(P＜0.05，P＜0.05)。与对照组比较，模型组Hp表达显著增高，高剂量和法莫替丁显著减低其表达(P＜ 0.01，P＜ 0.05)。

2.3 和胃宝对COX2、iNOS原位表达的影响

免疫组织化学显示，COX-2和iNOS在溃疡基底部的表达显著升高，与模型组比较，和胃宝高、中剂量组显著降低COX-2(P＜0.01，P＜0.05)表达水平。与模型组比较，法莫替丁组显著降低COX-2表达(P＜0.05)，未显著降低iNOS的表达(图2-3)。

表1 和胃宝对小鼠血清SOD、MDA、Hp、COX-2和 iNOS 表达水平(±s)

表1 和胃宝对小鼠血清SOD、MDA、Hp、COX-2和 iNOS 表达水平(±s)

注:与正常组比较:△P ＜0.05，▲P ＜ 0.01;与模型组比较 :*P ＜ 0.05，#P ＜0.01

iNOS组别SOD(nmol/ml)MDA(u/ml)Hp表达平均秩次COX-2平均秩次 平均秩次对 照 组 125.70±19.75# 15.46 ±6.76# 11.90# 27.82# 61.97#模 型 组 91.81±17.98▲ 29.06 ±9.22▲ 45.40▲ 128.22▲ 107.13▲和胃宝 低 剂量 100.42±19.28▲ 26.65 ±5.89▲ 41.30▲ 114.52▲ 100.03▲和胃宝 中 剂量 110.82±18.88* 24.67 ±10.18▲ 31.50△ 101.43▲＊ 91.34△和胃 宝 高 剂 量 119.93±21.58# 21.82 ±6.44* 25.50# 75.85▲# 83.07法 莫 替 丁 102.46±15.78▲ 20.93 ±6.12* 27.40△＊ 95.17▲# 93.58△

图2 和胃宝对胃溃疡模型小鼠胃黏膜COX-2表达的影响(×100)

图3 和胃宝对胃溃疡模型小鼠胃黏膜iNOS表达的影响(×100)

2.4 和胃宝对胃溃疡组织COX-2、iNOS蛋白表达的影响

图4显示，蛋白免疫印迹显示，与对照组比较，COX-2和iNOS在模型组显著升高(P＜0.01，P＜0.01)。与模型组比较，和胃宝高、中剂量组显著降低 COX-2(P＜0.01，P＜0.01)表达水平，法莫替丁组显著降低COX-2(P＜0.01)，和胃宝和法莫替丁对iNOS表达水平比较，差异无统计学意义。

3 讨论

幽门螺杆菌和非甾体抗炎药是损害胃肠保护机制导致胃溃疡发病的最常见病因，胃酸在溃疡形成中起关键作用。我们应用幽门螺杆菌感染联合冰醋酸复合造模法形成胃溃疡，模型组小鼠黏膜损伤至肌层、Hp抗体表达水平升高，提示模型复制成功，且与人类的胃溃疡形成机制相似［5］。

图4 和胃宝对胃溃疡模型小鼠COX-2和iNOS表达的影响

胃溃疡属中医学“胃痛”、“吐酸”、“嘈杂”等范畴，感受外邪，损伤胃黏膜;内伤饮食，“积滞中焦，久郁成热，则本从火化，因而作酸”(《证治汇补·吞酸》)，二者合邪，损伤胃府，胃痛乃成。《素问·至真要大论》曰:“诸呕吐酸，暴注下迫，皆属于热”，故和胃宝主要选用苦参、木瓜、乌贼骨、白及、大黄、金银花、白芍、甘草清热解毒、缓急止痛、敛疮生肌，治疗胃溃疡每收良效。和胃宝的3个剂量组均显著改善胃溃疡模型黏膜损伤，高、中剂量组降低血清Hp表达水平，并呈疗效剂量依赖关系，与我们此前的临床试验结果相一致［1，2］。

我们设计本动物实验的目的在于克服难以取得临床样本和服药依从性的问题。结果显示，模型组SOD水平降低和MDA水平增高，显示Hp感染和低酸等造成胃内抗氧化剂明显降低，诱发胃内的氧化应激反应，N-亚硝基化合物和反应性氧代谢产物(reactive oxygen metabolites，ROM)显著增加［6］，Hp感染结合乙醇和去氧胆酸钠的复合胃炎模型结果支持我们模型的变化趋势［7］。临床研究表明，Hp显著降低胃溃疡炎症病人SOD含量、增加ROM含量，表明Hp引起的脂质过氧化反应是胃黏膜损伤的重要因素［8］。和胃宝中、高剂量组增高小鼠血清SOD活力，高剂量组降低MDA水平，表明和胃宝可能通过改善黏膜氧自由基的堆积，减少胃黏膜细胞变性、坏死，保护胃黏膜，促进溃疡愈合。

抑制COX-2能够显著降低二甲基亚硝胺诱发的肝损伤，并降低 MDA［9］，COX-2抑制剂能够增加SOD并减少MDA水平，和胃宝通过COX-2抑制作用降低MDA、升高SOD水平。综上，以清热解毒为组方核心的和胃宝，可能通过调节COX-2通路，抑制Hp诱导的脂质过氧化反应，促进胃溃疡愈合。

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