戊己丸不同配伍方对结肠平滑肌细胞5-HT 3，4受体及下游信号传导通路主要元件的影响*

王迎寒，周淑媛，巩仔鹏，杨 庆，王娅杰，朱晓新△

(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;2.承德医学院，河北承德 067000)

戊己丸源于《太平惠民和济局方》，由黄连、吴茱萸和白芍组成。其中黄连为君，味苦性寒，善清火燥湿;白芍味酸甘，入肝经，可柔肝缓急、健脾益气，为臣;吴茱萸辛热，温中健脾开郁并引热下行，三药合用共奏疏肝理脾、健脾和胃之功，符合中医治疗脾胃病以“健脾祛湿以运中焦、调肝理气以畅气机”的治疗大法［1］，为治疗肝脾不和所致腹痛泄泻的常用方剂，临床中常用于治疗胃肠道炎症及肠易激综合征(IBS)。胃肠动力障碍是IBS的主要病理生理之一，至今仍备受关注。随着科研方法和研究手段的不断进步，对于胃肠运动的研究已经从在体运动和离体肌电、肌动的宏观水平深入到单个细胞、细胞器甚至分子水平。平滑肌细胞是胃肠运动的基本单位，也是研究胃肠运动的靶细胞。

前期实验中我们发现，戊己丸不同配伍方能改善炎症后IBS(PI-IBS)模型大鼠的结肠运动，其作用机制可能与参与调节结肠和中枢边缘系统内5-羟色胺(5-HT)含量，以及 5-HT 3，4受体(5-HT 3，4 R)、环磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+含量有关。但由于在体胃肠运动受到诸多神经及其递质的调节，机制非常复杂。因此，本实验拟采用分离培养的大鼠结肠平滑肌细胞在离体状态下，以5-HT 3，4R为切入点，戊己丸不同配伍方对胃肠运动的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD雄性SPF级大鼠，体质量250～300g，购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所(SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 试剂及仪器 (1)主要试剂:大豆胰蛋白酶抑制剂(批号 T6522)、Ⅱ型胶原酶(批号C6885)、高糖 DMEM(批号 12100-046)、小牛血清(批号 00548)、HTR3A antibody(批号 GTX85866)Flou 3A荧光探针(批号20071101)、α-actin(批号bs-0189R)、兔 Streptavidin-HRP试剂盒 (批号CW2035)、5-HT4 receptor antibody(批 号GTX30983)、山羊抗兔IgG(H+L)DyLight649(批号CW0232)、大鼠 cAMP酶联免疫试剂盒(批号F15181)、大鼠 PKA酶联免疫试剂盒(批号F16577)、HEPES Ringer缓冲液(每1L中含HEPES 5.839g，NaCl 5.902 g，KCl 0.969 g，NaH2PO40.39 g，CaCl20.2 g，MgCl20.24 g，谷胺酸钠 0.936 g，谷胺酰胺 0.292 g，葡萄糖 2.279 g，BSA 1 g，pH 至7.2，过滤除菌);(2)主要仪器:SORVALL LEGEND RT+冷冻高速离心机(Thermo SCIENTIFIC)、CKX41倒置显微镜(OLYMPUS)、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)、MCO-20AICCO2INCUBATOR(SANYOElectric CO.，Ltd)、FV1000 激 光 共 聚 焦 显 微 镜(OLYMPUS)、IX81 倒置显微镜(OLYMPUS)、ELX800型酶标仪(BIO-TEK INSTRUMENTS，INC)。

1.1.3 药物 苯基双胍(B)(批号P1002)、阿洛司琼(A)(批号sc-210788)、替加色罗(T)(批号sc-212993)、GR113808(GR)(批 号 G5918)、SQ22536(SQ)(批号 S153)、Forskolin(F)(批号F6886)、戊已丸提取物:黄连、制吴茱萸、炒白芍饮片购自北京卫仁饮片厂，并经中国中医科学院中药研究所鉴定，黄连醇提物、吴茱萸醇提物、白芍水提物由中日友好医院剂型室按照优选工艺分别进行提取;将单味药按L9(34)正交表(黄连、吴茱萸、白芍各有3个剂量水平交互配比成戊己丸9个不同配伍方)，以黄连、吴茱萸及白芍的比例分别为12∶2∶3，12∶1∶12 为受试的1 号方(W1)和2 号方(W2)［2］。

1.2 方法

1.2.1 结肠平滑肌的分离、培养及鉴定 参考Bitar方法［3］，每次取2只大鼠分离结肠平滑肌细胞，Trypan蓝染色法检查细胞活性，确认活细胞在90%以上。调细胞浓度至5×105/mL接种于培养瓶中，37℃ 95%O2和5%CO2条件下培养。24 h后换液，以后每3 d更换培养基1次，期间用倒置显微镜观察细胞生长情况。10d左右，细胞长满90%培养瓶底时按1∶3比例传代。并取原代细胞进行爬片，行α-actin免疫组织化学染色［4］。

1.2.2 戊己丸储备液的配制 1号方提取物(黄连0.1927 g，吴茱萸0.0294 g，白芍0.02335 g)和2号方提取物(黄连0.1927 g，吴茱萸0.0147 g，白芍0.0934 g)溶于双蒸水中，DMSO助溶，均定容至10 mL，4℃保存，临用时用无血清的培养基稀释到0.62 g/L和0.75 g/L，过滤除菌后应用。

1.2.3 观察指标 (1)免疫荧光法检测大鼠结肠平滑肌细胞5-HT 3，4R:收集第2代平滑肌细胞，消化后调细胞浓度为5×105/mL，接种于预先放置盖玻片的24孔板中爬片。2d后换新鲜培养基，同时加入1号方或2号方溶液和工具药(B或A或T 或 GR，12.5μg/mL)溶液各50μL，同时设空白、工具药及戊己丸对照孔，每孔总体积为500μL，置于培养箱中培养24h。免疫荧光染色主要步骤:取出细胞爬片，用PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定，正常山羊血清封闭;一抗孵育(5-HT3R或5-HT4R，1∶100)，4℃过夜，PBS 洗;荧光二抗(1∶100)37℃避光孵育60 min，PBS洗;蒸馏水漂洗1次封片，激光共聚焦显微镜下观察。每张片子随机取3～5个视野并拍照，用软件FV1000计算荧光强度;(2)激光共聚焦显微镜检测大鼠结肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度:取第2代平滑肌细胞，消化后调细胞浓度为1×105/mL，接种于激光共聚焦专用培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基2mL，于培养箱中静置培养，贴壁后加入1号方或2号方，继续培养12h，PBS洗3次，加入4μmol/L的 Fluo-3/AM 工作液，37℃培养20min，再加入5倍体积含1%胎牛血清的HBSS，继续培养40 min，PBS洗3次，皿中留1 mL PBS待测。激光共聚焦显微镜下，488nm，20倍扫描成像，每个样本扫描加入刺激剂前及加入刺激剂5 min时的图像，比较荧光强度变化，以荧光强度表示胞内游离钙的水平。刺激剂分别为A、B、T和GR，终浓度均为1.25μg/mL;(3)双抗夹心法检测大鼠结肠平滑肌细胞内cAMP，PKA浓度:第2代平滑肌细胞消化后，调细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔板中，每孔20μL，补足新鲜培养基，每孔总体积为200μL，置于培养箱培养。2d后每孔换新鲜培养基180μL，同时加入1号方或2号方溶液20μL，置于培养箱中培养24h。再加入工具药(T或GR或F或SQ)，使工具药的终浓度分别为1.25μg/mL、1.25μg/mL、1 nmol/mL、0.5 nmol/mL，培养 0.5h。同时设空白对照、工具药及戊己丸对照孔，每个药物均设3个复孔，重复3次。培养结束后，弃去培养上清，PBS洗3次，然后每孔加入 PBS 200μL，反复冻融3次，－80℃保存。采用双抗夹心法进行检测cAMP和PKA浓度。

2 结果

2.1 大鼠结肠平滑肌的培养及鉴定

如图1、2所示，在培养10d左右，原代培养的大鼠结肠平滑肌细胞呈梭型，排列紧密，生长状态良好。经α-actin免疫组化鉴定，分离培养的细胞胞浆内分布大量黄色颗粒(图4)，而阴性对照细胞胞浆内无着色(图3)，分离培养的细胞鉴定为大鼠结肠平滑肌细胞。

2.2 戊己丸不同配伍方对平滑肌细胞5-HT 3，4R 的影响

表1显示，与NC组比较，1号方和2号方均可显著降低5-HT3R荧光强度(P＜0.01)。经A和GR处理后，5-HT 3，4R荧光强度明显增高;两方均可使其显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。经B和T处理后，5-HT 3，4R荧光强度明显降低，两方均能显著促进其下降(P＜0.05，P＜0.01)，1号方和2号方 之间差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

图1 培养10d左右的SMC(×10)

图2 培养10d左右的SMC(×20)

图3 阴性对照(×20)

图4 SMC α-actin 组化染色(×20)

表1 平滑肌细胞5-HT 3，4R表达比较(±s)

表1 平滑肌细胞5-HT 3，4R表达比较(±s)

注:与 NC组比较:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01;与 W1组比较:△P＜0.05，△△P ＜0.01(下同)

R组别5-HT3 5-HT4R 26 W1 935.92±108.52＊＊ 1434.61±56.07* 676.59±54.67＊＊ 1193.72±73.23＊＊ 987.47±93.99* 1544.54± 68.67＊＊W2 777.19± 76.74＊＊△ 1336.48±34.34＊＊△ 574.73±60.77＊＊△△ 1093.41±64.84＊＊△ 809.37±97.90＊＊△△ 1419.57± 84.04 GR NC 1250.77± 89.49 1596.64±99.41 802.79±45.59 1371.56±95.33 1125.51±76.22 1776.07±110.无工具药 A B 无工具药T＊＊△

2.3 戊己丸不同配伍方对平滑肌细胞内游离Ca2+的影响

表2显示，1号方和2号方均可使大鼠结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度显著下降(P＜0.01)。经A和GR处理后，Ca2+浓度均显著下降，两方均可显著促进其下降(P＜0.01)。经B和T处理后，Ca2+浓度均显著升高，两方均可使其明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，1号方和2号方之间差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 平滑肌细胞内游离Ca2+比较(±s)

表2 平滑肌细胞内游离Ca2+比较(±s)

组 别 无工具药.01±10.86 161.42±7.02 W1 151.05±6.55＊＊ 128.11±5.64＊＊ 220.31±11.72＊＊ 221.35±14.39* 142.14 ±5.80＊＊W2 136.90±4.02＊＊△ 113.56±2.39＊＊△ 198.05± 7.14＊＊△ 193.90±12.44＊＊△ 121.02 ±5.26 GR NC 181.42±8.77 150.71±8.64 254.61±12.94 260 A B T＊＊△△

2.4 戊己丸不同配伍方对平滑肌细胞内cAMP、PKA 的影响

表3、4显示，1号方和2号方均可使平滑肌细胞内cAMP和PKA显著下降(P＜0.01)。经T和F处理后，cAMP和PKA均显著升高，两方均可使其明显下降(P＜0.05，P＜0.01)。经GR和SQ处理后，cAMP和PKA均显著降低，两方均可明显促进其下降(P＜0.05，P＜0.01);1号方和2号方之间差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 平滑肌细胞内cAMP的比较(pmol/mL，±s)

表3 平滑肌细胞内cAMP的比较(pmol/mL，±s)

组 别 无工具药8.17±0.46 W1 8.17±0.59＊＊ 11.50 ±0.48＊＊ 7.51±0.18＊＊ 11.56±0.30＊＊ 7.67±0.34*W2 7.31 ±0.59＊＊△ 10.22 ±0.44＊＊△△ 6.76 ±0.37＊＊△△ 9.68 ±0.64＊＊△△ 6.78 ±0.40 GR F SQ NC 9.41±0.32 13.07±0.68 8.29±0.19 13.78±0.53 T＊＊△△

表4 平滑肌细胞内PKA的比较(pg/mL，±s)

表4 平滑肌细胞内PKA的比较(pg/mL，±s)

组 别 无工具药.91 15.83±1.71 W1 15.28±1.91＊＊ 37.39 ±3.37＊＊ 13.82±1.14＊＊ 33.19±2.15* 12.35±2.03＊＊W2 12.63 ±2.26＊＊△ 31.45 ±3.50＊＊△△ 11.07 ±1.54＊＊△△ 28.43 ±1.68＊＊△△ 10.07 ±1.28 GR F SQ NC 20.30±1.95 46.43±3.12 16.65±1.46 42.41±4 T＊＊△

3 讨论

5-HT3受体是阳离子通道受体，5-HT4受体是G蛋白偶联受体，两者均广泛分布于胃肠道的黏膜层、肌层和肠神经系统，可由5-HT激活，参与胃肠运动的调节。越来越多的研究表明，肠易激综合征患者5-HT 3，4受体表达异常，是肠易激综合征的发病机制之一。本实验中戊己丸不同配伍方在离体状态下可抑制5-HT 3，4受体的表达，从而拮抗5-HT 3，4受体介导的胃肠运动加快，这可能是其改善PIIBS大鼠结肠运动的作用机制之一。目前的研究报道虽未查到戊己丸及其组分可下调5-HT 3，4受体表达的报道，但其作用却是真实存在的。

Ca2+在介导平滑肌收缩反应中起核心作用，其浓度的升高依赖于胞外Ca2+内流或胞内贮存Ca2+释放。胞外Ca2+内流起主要的作用，通过电压门控钙通道、钙库调控性钙通道和受体操纵性钙通道3种方式介导［5］，但起主要作用的是电压门控钙通道，尤其是 L-型钙通道［6，7］。5-HT 作用于 3、4 受体后均可激活L-型电压门控钙通道，使平滑肌细胞内Ca2+增多。戊己丸中小檗碱作为钙通道拮抗剂，在抑制Ca2+内流上起重要作用;而戊己丸又可下调3、4受体的表达，使L-型电压门控钙通道的激活减少，Ca2+内流亦随之减少，从而使胞内Ca2+浓度下降，平滑肌收缩减慢。

cAMP作为第二信使，其调控作用广泛分布于胃肠道的黏膜层、肌层以及肠神经系统中，对胃肠道的运动、内脏感觉及分泌都具有非常重要的调节作用，可由AC活化而产生，进一步激活PKA，影响多种蛋白的磷酸化及离子通道的激活或失活，使细胞对外界刺激产生反应。5-HT4R的活化能使其增加。现代药理研究表明，黄连、白芍及芍药苷均能调节cAMP信号传导通路［8～10］，说明戊己丸下调平滑肌细胞cAMP水平可能是其改善结肠运动的作用机制之一。

由此我们推测，在无神经和体液的干预下，戊己丸可以通过调节平滑肌细胞的5-HT 3，4R及cAMP水平，影响细胞的收缩舒张运动，此作用可能是其改善PI-IBS大鼠结肠运动的作用机制之一。在本实验中，2号方的作用优于1号方，其原因可能是两方中吴萸和白芍的用量差别较大，而中药复方疗效不同于单味药的相加，其作用随方中用药比例不同而有差异［11，12］。

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