薤白对络气郁滞型血管内皮功能障碍大鼠的作用及机制研究*

吴相锋，李 铮，来 静，吴相春，，贾振华，，王宏涛，王玲玲

(1.河北医科大学附属以岭医院(国家中医药管理局中医络病学重点学科，石家庄 050091);2.国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，石家庄 050035;3.石家庄市第三医院，石家庄 050017)

薤白为百合科葱科植物小根蒜Allium macrostemonBunge和薤Allium chineseG·Don的干燥鳞茎，味辛、苦，性温、无毒，具有温中通阳、畅通络气、宽胸散结之功效，为胸痹心痛之要药。现代研究表明，薤白的化学成分构成含有多种活性成分，主要含大蒜氨酸、甲基大蒜氨酸、大蒜糖，醇提取物含有前列腺素。具有抑菌消炎、解痉平喘、抗血小板聚集作用，以及抗氧化作用、降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、镇痛作用［1］。本研究观察了薤白提取物对络气郁滞型血管内皮功能障碍大鼠血管内皮功能、结构及主动脉组织内质网标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康清洁级Wistar雄性大鼠30只，体质量200～230g，购于北京维通利华实验动物中心(许可证号SCXK(京)2007-0001)。

1.1.2 药物 薤白提取物:由河北以岭医药研究院提供，用0.5%CMC-Na配制成0.12g生药/ml的混悬液，4℃保存备用;蛋氨酸由河北省农科院提供，并由河北省实验动物中心制作成3%的高蛋氨酸饲料，纯度 99.9%(批号 B7NE-05-0007-MC02);血清一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物试剂公司提供，血浆内皮素(ET)由北京普尔伟业生物科技有限公司提供，Goldview为赛百盛公司产品，BCA法蛋白浓度定量试剂盒、ECL发光检测试剂盒由Pierce公司提供。抗大鼠GRP78/Bip多克隆抗体由Cell Signaling提供。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法 清洁级雄性Wistar大鼠30只，将大鼠按体质量随机分为空白对照组、络气郁滞型血管内皮功能障碍组(以下简称模型组)和薤白组3组。参照本室的方法［2］，实验开始时即将大鼠放入束缚盒内，调节前端活动部位到合适的位置，使大鼠不产生强烈反抗的紧张程度，每天6h，给予3%蛋氨酸饮食，时间为6周。空白对照组给予正常饮食。

1.2.2 给药 实验第1天薤白组给予薤白1.2g生药/(kg·d)灌胃，用0.5%CMC-Na溶液配制成混悬液，其余2组按体质量灌服0.5%CMC-Na溶液。各组喂食饲料不变，实验共6周，每周6次。

1.2.3 标本采集 实验末10%水合氯醛麻醉，颈动脉取血后，迅速剪开胸腔分离胸腹主动脉，于主动脉弓处取一段血管置于4%多聚甲醛溶液中固定，以备HE染色，光镜观察。仔细分离并截取一小段动脉，预冷生理盐水冲洗，迅速浸入电镜液中，修成1mm×1mm×1mm大小组织块，迅速置于2.5%的戊二醛固定液，用于透射电镜观察;每组3只大鼠无菌取主动脉组织迅速投入液氮中，然后于－80℃冻存待测GRP78的表达。

1.2.4 血清NO、血浆ET的检测 分离血清、血浆后冻存，硝酸还原酶法检测血清NO(白求恩国际和平医院完成)，放免法检测血浆ET-1(解放军总医院完成)。

1.2.5 光镜组织学观察 常规HE染色，光镜观察。

1.2.6 透射电镜组织学观察 经1%的锇酸固定、割断、酒精逐级脱水、临界点干燥和离子金属镀膜，用日立 H-7500透射电镜观察、拍照(河北医科大学电镜室完成)。

1.2.7 Western blot法测定GRP78的表达 取血管组织经液氮研磨后加入1ml RIPA裂解液冰上裂解 30min，4℃、3000rpm离心 20min吸取上清，BCA法测定总蛋白浓度，用样品缓冲液稀释至7.5ug/ul。取 150ug蛋白样品进行 12%的 SDSPAGE凝胶电泳，待溴酚蓝接近凝胶底部时停止电泳，4℃、120V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭 1h。分别加入1∶750稀释的 GRP78/Bip一抗和1∶500稀释的 β-actin(内参)一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)室温孵育 1h，TBST洗膜5min×3次。ECL发光显色，凝胶成像系统照相，实验结果采用Quantity One软件分析，扫描灰度值，以目的蛋白与内参β-actin的比值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠之间ET、NO的变化

表1显示，与正常对照组比较，复合模型组大鼠血浆ET明显升高，血清NO明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。与复合模型组比较，薤白组大鼠的 ET水平明显降低，NO水平明显升高(P＜0.01)。

表1 各组大鼠 ET、NO水平的变化比较(±s，n=10)

表1 各组大鼠 ET、NO水平的变化比较(±s，n=10)

注:与正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组 别 ET(pg/ml) NO(umol/L)正常组142.91± 8.72 45.22±12.42模型组 178.25±21.85＊＊ 24.91± 9.95*薤白组 153.47± 9.36## 56.12±21.30##

2.2 形态学观察

2.2.1 各组大鼠主动脉组织光镜的变化 图1显示，正常组主动脉内膜、中膜、外膜形态基本正常，结构完整。模型组内皮细胞肿胀、分布不均匀、密度增加，内膜有多量淋巴细胞附壁，内膜内有炎细胞浸润，内弹力板有断裂，平滑肌可见明显水肿。薤白组可改善模型大鼠的主动脉大体形态。

图1 各组大鼠主动脉组织HE染色变化比较(×400)

2.2.2 各组大鼠主动脉内皮细胞超微结构的变化 图2显示，正常组内皮细胞形态规则，细胞核及细胞器存在，线粒体结构无异常。模型组内皮细胞线粒体大部分嵴和少部分膜融合或消失，几乎见不到粗面内质网和吞饮小泡。薤白组可改善模型大鼠主动脉组织内皮细胞的超微结构。

图2 各组大鼠主动脉组织内皮细胞超微结构变化比较(×20000)

2.3 各组大鼠主动脉组织GRP78蛋白表达变化

图3显示，与正常组比较，模型组主动脉组织GRP78蛋白表达显著增强(P＜0.05)。与模型组比较，薤白组GRP78蛋白表达量明显降低(P＜0.05)。

图3 各组之间GRP78表达变化

3 讨论

血管内皮细胞在维持血管正常功能方面起着重要作用，内皮细胞不仅是血液和组织间进行交换的屏障，而且可合成和分泌多种生物活性物质，如NO、ET。NO/ET是一对具有拮抗效应的血管活性物质，两者合成释放作用的协调是维持血管张力的主要因素之一。高同型半胱氨酸(HHcy)血症是血管内皮功能障碍的危险因素，Hcy的氧化应激反应在很大程度上解释了Hcy诱导的内皮功能损害，然而同样是含硫氨基酸，半胱氨酸在体内的浓度远高于Hcy水平，虽然半胱氨酸也能产生活性氧物质，但并不引起内皮细胞损伤。抗氧化剂如N-乙酰-L-半胱氨酸、维生素C、E和过氧化氢酶等均不能抑制Hcy诱导的内皮细胞凋亡，这提示可能存在除氧化应激外的其他机制介导Hcy诱导内皮细胞损伤。不少学者提出内质网应激学说［3］，在心血管系统中，内质网应激作为多种应激过程的共同通路，广泛地参与多种心血管疾病的发生。有研究发现，在培养的血管内皮细胞中，HHcy诱导的内质网应激激活［4］。GRP78是一重要的内质网分子伴侣，当内质网应激发生时，GRP78作为一种代偿而增多，促进蛋白质的折叠。Hcy引起严重或长期的内质网应激可以使一些参与血管病变形成的分子功能紊乱，其中包括脂质代谢、细胞凋亡和炎症的调节障碍［5］。络气郁滞证候能造成明显的内皮功能障碍，可能与主动脉组织内质网应激有关［6］。

本研究应用慢性束缚法与3%蛋氨酸饮食相复合建立络气郁滞型血管内皮功能障碍病证复合动物模型，并用流气畅络药薤白提取物进行预防性干预。结果显示，模型组血清NO含量明显下降，血浆ET明显升高，主动脉组织形态及内皮细胞超微构发生明显改变，GRP78蛋白表达明显增强。薤白提取物可明显降低复合模型大鼠血浆 ET水平，升高血清NO水平，抑制主动脉组织GRP78蛋白的表达。实验表明，模型大鼠存在明显的血管内皮功能障碍和主动脉组织内质网应激，薤白提取物能改善模型大鼠的血管内皮功能，明显抑制主动脉组织的内质网应激。提示薤白提取物可能通过降低模型大鼠主动脉组织GRP78蛋白的表达，抑制模型大鼠的内质网应激来改善模型大鼠血管内皮功能，防止血管内皮细胞受损，详细机制有待于进一步探讨。

［1］吴以岭.络病学［M］.北京:中国科学技术出版社，2005:415-418.

［2］吴相春，吴以岭，贾振华，等.络气郁滞型内皮功能障碍大鼠动物模型的建立和评价［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14(1):30-32.

［3］严江涛，汪道文.同型半胱氨酸与血管内皮功能失调的关系及其分子机制的研究进展［J］.临床心血管病杂志，2004，20(4):254-256.

［4］娄利霞，唐朝枢.内质网应激与心血管疾病［J］.中国分子心脏病学杂志，2005，5(2):496-499.

［5］王晓红，张卫光，林胜利，等.四氯化碳诱导性肝硬化大鼠肝组织葡萄糖调节蛋白78表达的研究［J］.解剖学报，2006，37(13):290-293.

［6］吴相春，来静，李爱然，等.络气郁滞证大鼠主动脉组织葡萄糖调节蛋白78mRNA表达的研究［J］.北京中医药，2010，29(6):449-451.