中药六味地黄汤抗大鼠卵巢组织衰老的机制

王方娜 李亚丽 楚伟 何金波

衰老是一个复杂的形态与功能变化的过程，细胞周期停滞于G1期是细胞衰老的一个关键特征。目前研究较为明确的细胞衰老途径主要有两条［1］：p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb途径。这两条衰老途径的关键调节因子是几个抑癌基因：p53、p19ARF、Rb和p16INK4a。一旦这些基因发生突变，细胞将发生早老或绕过衰老程序继续增殖。因此通过抑制衰老途径中相关基因表达的治疗已成为防治衰老的新策略。近年来大量文献报道性腺功能衰退与机体衰老密切相关［1，2］。研究性腺衰老机制及药物的调节作用已成为衰老研究的热点之一，而且主要集中在雄性性腺衰老的研究［2-4］，但对于雌性性腺衰老的研究报道尚少。本研究应用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型，以大鼠卵巢为研究对象，应用RTPCR、Western blotting方法检测并分析应用六味地黄汤对衰老大鼠卵巢组织p16、p19ARF、Rb表达的影响，探讨六味地黄汤在衰老途径中抗鼠性腺衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用清洁级8周龄雌性SD大鼠75只，体重180～220 g(购自河北医科大学实验动物学部，合格证编号：605106)。根据实验目的和要求将SD大鼠随机分为以下各组，正常对照组、模型组、六味地黄汤组、VE阳性对照组，每组15只。

1.2 动物模型的建立和4组动物的处理 用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老动物模型：用0.9%氯化钠溶液配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1给药，连续60 d，1 次/d。六味地黄汤组和阳性对照组大鼠在造模的同时每天灌胃六味地黄汤、维生素E，连续60 d。

1.3 药物溶液的制备 六味地黄汤方剂组成：熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻等，按重量比 8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，过滤后浓缩至含生药为1 g/ml。4℃保存，给药前复温至25～30℃。维生素E溶液：用0.5%羧甲基纤维素钠稀释为含维生素 E 0.0055 g/ml药液。4℃保存，给药前复温至25～30℃。

1.4 方法

1.4.1 设备与试剂：D-半乳糖购于北京化学试剂公司;TUNEL试剂盒购自Roche生物试剂公司;β-Actin单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供;PCR仪(美国MJResearch公司);羊抗Rb多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司;Gel-Pro Analyzer 4.0电泳图像定量分析系统购自美国media cybernetics公司。

1.4.2 RT-PCR的检测：总RNA的提取按Trizol Reagent说明书进行。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。见表1。

表1 RT-PCR分析的引物

PCR过程：以总RNA为模板，以Oligo(dT)16为引物，按AMV(Promega)说明书反转录合成cDNA。以cDNA为模板，加入p53 cDNA上、下游引物，以 β-actin为内参照，进行 PCR。PCR扩增反应体系：取5μl反转录产物作为PCR反应模板，依次加入 dNTPs混合物(终浓度 0.2 mmol/L)，MgCl22.5 mmol/L，上、下游引物(终浓度50 pmol/L)，10×PCR缓冲液2.5μl，Taq DNA聚合酶2 U，加无菌去离子水至总体积25μl，置PCR仪上进行扩增。设定反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 个循环后，72℃延伸7 min。最后取10μl PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，运用凝胶成像系统对条带进行吸光光度值分析。以p53/β-actin平均吸光度比值表示p53的mRNA水平，进行半定量分析。

1.4.3 Rb蛋白含量的检测：大鼠断头处死，取出垂体、卵巢组织迅速投入液氮中，待用。卵巢细胞Rb蛋白提取及Western Bloting法检测各组大鼠卵巢Rb蛋白的检测，将组织从液氮中取出，研磨器中加入少许细胞裂解液(0.15 mol/L，NaCl，5 mmol/L，EDTA，1%TritonX-100，10 mmol/L，pH 值 7.4 Tris-HCl，1∶1 000 的 5 mol/L DTT，1∶1000 的100 mmol/L PMSF)，将组织研磨成浆后离心取上清。用蛋白定量测定试剂盒进行总蛋白测定，获得每个组织的总蛋白浓度。电泳分离蛋白。用TBST清洗PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭2 h，分别加入Rb、β-actin等抗体(抗体稀释度1∶200 ～1∶500)，摇床常温孵育1 h，4℃过夜，TBST清洗，15 min/次，3次;加入过氧化物酶标记的二抗，(用含2.5%脱脂奶粉的TBST稀释，稀释度为1∶1 000)，摇床常温孵育1 h，TBST清洗，5 min/次，3次。在PVDF膜上滴加酶的作用底物ECL，作用3 min后滤纸吸干，塑料保鲜膜包裹后放入暗匣，压X光底片曝光2～5 min，显影，定影。将清晰的条带扫描后输入图像分析系统，结果以Rb/β-actin的OD比值表示。

1.5 统计学分析应用SPSS11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用One-Way ANOAY方差分析，均数间两两比较进行SNK法Q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 在正常大鼠卵巢组织中，p53、p19ARF、Rb、p16基因表达较低，模型组大鼠卵巢组织内p53、p19ARF、Rb、p16表达上调(P＜0.05)，给予六味地黄汤治疗后可以降低其表达(P ＜0.05)。见表1。

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢组织中转录水平的分析结果n=15，±s

表1 各基因mRNA在大鼠卵巢组织中转录水平的分析结果n=15，±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

六味地黄汤组 0.39±0.04# 0.59±0.01# 0.62±0.06# 0.75±0.012#VE阴性对照组 1.90±0.07*# 0.65±0.05*# 0.80±0.01*#1.05±0.21*#

2.2 Westernbloting结果 在正常大鼠卵巢组织中，Rb蛋白表达较低，模型组大鼠卵巢组织内 Rb蛋白表达上调(P＜0.05)，给予六味地黄汤治疗后可以降低明显其表达(P＜0.05)。见表2。

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢组织中表达水平的分析结果±s

表2 Rb蛋白在大鼠卵巢组织中表达水平的分析结果±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

模型组六味地黄汤组 0.59±0.16#VE阳性对照组 0.81±0.31*#

3 讨论

p53基因是一种抑癌基因，亦是衰老基因，在p53衰老途径中，p19ARF是p53的正性调节因子，p19ARF蛋白可以抑制MDM2的活性，使其不能介导p53的降解，从而激活p53，而高度活化的p53促进细胞衰老［5］。在调控细胞老化的Rb途径中，p16、Rb基因的表达及功能的改变是细胞周期停滞的根本原因。Rb蛋白以其不同的活性状态调控着细胞G1-S调控点，决定细胞增殖或进入生长停滞。p16蛋白是一种细胞周期抑制蛋白，可以阻断CDK4-6途径对Rb蛋白的磷酸化，非磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F相结合，阻止细胞进入S期，使细胞周期停滞，Rb与p16相互作用，影响着细胞的衰老［6］。这两条衰老途径中任何一条途径活化均可以导致细胞衰老，但两条途径间存在着广泛的多层次的联系，常常共同参与细胞衰老过程。

本研究结果显示：D-半乳糖诱导的衰老大鼠卵巢组织p53、p19ARF、Rb以及p16基因表达明显比正常组上调，说明衰老模型大鼠的卵巢组织表达衰老信号。应用六味地黄汤后，大鼠卵巢组织的p53、p19ARF、Rb以及p16的表达均下降，因此推测p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb两条衰老途径在大鼠卵巢组织衰老的过程中可能均发挥重要的作用。

综上所述，六味地黄汤不仅在基因水平抑制了大鼠卵巢的衰老，而且这种抑制作用也表现在分子水平。六味地黄汤是通过抑制两条衰老途径中关键的调节因子发挥作用，继而可能抑制了衰老信号进一步向下游转导，从而起到抗衰老的作用。因此，六味地黄汤是一种具有良好应用前景的抗衰老药物。

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2 陈志宏，龚秀云，李健，等.何首乌丸加味干预后衰老模型大鼠睾丸生精细胞p53基因表达的变化.中国组织工程研究与临床康复，2007，11：3379-3381.

3 黄健.六味地黄丸合甘麦大枣汤对35例围绝经期综合征患者生殖内分泌功能的调节.福建中医药，2008，39：1-2.

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