紫杉醇与雷帕霉素复合药物涂层支架预防冠脉再狭窄动物实验研究

王浩 李泱 张文辉 高伟 栗竞 李晓英 文毅 徐占稳 苟鹏 黄丽洁

冠状动脉内支架植入术是冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的主要手段，而药物涂层支架(Drugelutingstent，DES)能显著的降低支架置入术后的再狭窄和再次血运重建率，成为冠心病PCI发展史上新的里程碑。近年来，DES的研究主要集中在涂层载体、涂层药物及涂层工艺的研究上。涂层药物的研究有较快发展，但目前应用于临床最多的还是抗增殖药物紫杉醇与雷帕霉素。采用纳米技术涂层是近年新兴的支架涂层技术，具有生物相容性好、机械稳定性强的优点［1］。本研究观察一种新型的采用纳米技术涂层的紫杉醇与雷帕霉素复合药物涂层支架预防冠脉内再狭窄的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选用小型猪6头，均为雄性，体重17～20 kg。支架分为：A支架，中剂量紫杉醇+低剂量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇45.75μg、雷帕霉素58.5μg;B支架，中剂量紫杉醇+中剂量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇56.5μg、雷帕霉素123μg;C支架，低剂量紫杉醇+高剂量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇19.5μg、雷帕霉素417μg。

1.2 方法 小型猪喂饲1周适应环境，每头猪于术前3 d起口服阿司匹林，100 mg/d，硫酸氯吡格雷，25 mg/d。应用中国农业大学生产的“猪麻醉剂”进行全身麻醉(1 ml/10 kg)，抽血，穿刺，置入动脉鞘，动脉鞘内注入肝素全身肝素化，选择右冠状动脉，采用国际上公认的小型猪冠状动脉过度扩张的再狭窄模型［2］。测定血管直径，根据参考血管直径，用球囊以球囊/血管1.3∶1的比例，用10～15个大气压15 s单次过度扩张血管形成冠状动脉损伤模型，植入支架，球囊扩张压力为10个大气压×10 s，间隔1 min后在原部位12个大气压×10 s扩张。支架置入后重复冠状动脉造影以确定冠状动脉是否通畅。术后予以青霉素320万U、阿司匹林、氯吡格雷，继续喂饲6周。

1.3 冠脉造影判断冠脉再狭窄情况 术后6周麻醉，肝素化，进行右冠状动脉造影。2次造影术后抽血检测肝、肾功能。

1.4 组织间苯二酚品红染色法观察冠脉再狭窄情况 放血处死后取出心脏，保留部分升主动脉，4%多聚甲醛100 mm Hg加压灌注15 min，分离并取出含支架段血管，多聚甲醛固定48 h后，支架部位塑料包埋，组织学切片，HE染色，标本切片，Olympus显微镜拍照。组织学切片的横截面积由Image-Pro Plus专业图像分析软件(版本：5.0.2)进行形态测量与分析。标尺定标，随后测量以下指标：管腔面积(luminal area，LA)，即内膜包绕面积;内弹力板围绕面积(internal elastic lamima area，IELA)，内弹力板完整时通过内弹力板内缘测定，内弹力板断裂者以断裂处的中膜为边界，中膜亦断裂时以外弹力板为边界;外弹力板围绕面积(external elastic lamima area，EELA)，外弹力板内缘包绕的面积总和;中膜面积(media area，MA)，MA=EELA-IELA;新生内膜面积(neointima area，NIA)，NIA=IELA-LA;管腔狭窄程度(percent area stenosis，PAS)，PAS=LA/IELA ×100%。每个支架切片4～5张，分别测量后求均值。

2 结果

2.1 植入支架情况 6头猪存活4头，每头存活猪均在右冠状动脉内成功植入2枚支架，共在右冠状动脉内植入支架8枚。有2头猪术中发生室颤，死亡。见表1。

表1 植入支架一般情况

2.2 术前、术后生化结果 4只猪术前、术后各项生化指标无明显变化。见表2。

表2 术前、术后生化结果

2.3 造影情况 前后造影对比示1枚A支架内可见轻度狭窄，余各支架内均未见明显狭窄及闭塞病变。

2.4 病理结果 6周之后1枚A支架内发生狭窄，其血管管腔面积(LA)与其他A支架及B、C支架相比，明显减小(P＜0.05)，内弹力板围绕面积(IELA)、外弹力板围绕面积(EELA)及中膜面积(MA)无明显变化，新生内膜面积(NIA)裸支架组比A、B、C组支架明显增大(P ＜0.05)，管腔明显狭窄(P ＜0.05)。见表3、图1。

2.5 镜下观察狭窄A支架内膜增生明显，管腔明显狭窄，余A支架及B、C支架血管内膜无明显增生，管腔无明显狭窄。见表3，图 2、3。

表3 支架植入术后6周动脉形态学变化±s

表3 支架植入术后6周动脉形态学变化±s

注：与狭窄A支架比较，*P＜0.05

支架(n=2) 0.55±0.09 0.09±0.0285.9±7.76 C支架(n=2) 0.49±0.22* 0.58±0.06 1.25±0.11 0.67±0.06 0.09±0.01* 84.5±10.77*

3 讨论

DES的问世被誉为介入心脏病学领域的又一个“里程碑”，其有效性充分体现在能够显著降低再狭窄率方面。DES是将药物通过适当的方法涂布于支架表面，使之形成一个药物池，在血液的冲刷和溶解作用下，药物不断从支架表面洗脱，并在局部发挥作用。DES是支架、药物载体和涂层药物三者结合应用的产物，而涂层药物的选择是DES的核心。根据主要药理作用的不同，将涂层药物分为抗血栓药物、抗炎症药物、抗血管平滑肌细胞(VSMC)增殖药物、抗VSMC移行药物、促内皮愈合药物五大类，抗VSMC增殖药物是目前最受关注的一类药物，研究较多的包括雷帕霉素和紫杉醇等。雷帕霉素与紫杉醇作用机制完全不同，作用于细胞发育周期的不同阶段。雷帕霉素是一种细胞静止药物，体外研究结果提示能明显抑制大鼠和人血管平滑肌细胞的增殖［3］，其机制是阻断平滑肌细胞表面受体后的信号传导，使细胞增殖停止于细胞周期的G1晚期，阻断细胞周期G1期向S期的转变，从而抑制细胞增殖［4］。紫杉醇是临床常用的一种抗肿瘤药物，它的微管聚合作用能使细胞产生稳定而无功能的微管，低剂量时抑制细胞G0/G1期转变，高剂量时引起细胞M期阻滞，致细胞凋亡，可有效地抑制血管平滑肌细胞增殖、移形和基质形成［5］。

近年报道的复合药物涂层支架包括雷帕霉素-巴曲酶复合药物涂层支架［6］、雷帕霉素-替罗非班复合涂层［7］、雷帕霉素和甲氨蝶呤复合涂层［8］、雷帕霉素-缬沙坦复方药物洗释支架［9］。这些复合涂层应用的一般是不同作用机制的两种药物，而有关雷帕霉素与紫杉醇二者复合涂层的研究笔者尚未见报道。

本研究中支架载药量的确定参考了进口DES。美国BOS TON公司生产的TAXUS支架的紫杉醇含量为1.0μg/mm，最大型号支架(3.50×32 mm)的最高标称药物总含量为224μg，美国强生公司生产的CYPHER支架的雷帕霉素含量为140μg/cm，最大型号支架(4.00×33 mm)上的最大药量为419μg。本研究观察了三种剂量组合的复合涂层支架对6周后猪冠状动脉再狭窄的预防作用，以期寻找到一种合适的剂量组合，既可以减少涂层药物剂量，又可以起到充分的抑制新生内膜增生、预防支架内再狭窄的作用。结果显示除一枚中剂量紫杉醇+低剂量雷帕霉素支架发生了明显的再狭窄、内膜明显增生外，余支架均无明显再狭窄，提示中剂量紫杉醇+中剂量雷帕霉素及低剂量紫杉醇+高剂量雷帕霉素的组合可以完全预防短期内冠脉再狭窄，而中剂量紫杉醇+低剂量雷帕霉素的组合的有效性尚待进一步检验。

纳米药物是指以纳米级高分子载体与药物以一定方式结合在一起后制成的药物，也可以是直接将原料药物加工制成的纳米粒，其粒径可能超过100 nm，但通常应小于500 nm。纳米药物的粒径使它具有非凡的表面效应和小尺寸效应，与常规药物相比，它颗粒小、表面反应活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力强。因此，纳米药物具有能够提高生物利用度，减少用药量，减轻或消除不良反应的特点。既往已有纳米颗粒载药涂层支架研制成功的报道［10］，为PES的研究开拓了新的思路，随着研究的不断深入，纳米PES可能会给治疗血管内再狭窄带来更好的效果［11］。

图1 不同支架血管病变情况

图2 不同支架血管管腔狭窄程度

图3 6周后血管横断面(HE×40)

1 Tsujino I，Ako J，Honda Y，Fitzgerald PJ.Drug delivery via nano-，micro and macroporous coronary stent surfaces.Expert Opinion on Drug Delivery，2007，4：287-295.

2 Willette RN，Zhang H，Louden C，et al.Comparing porcine models of restenosis.In Tumbleson ME，and Schook LB(eds)，Advances in swine in biomedical research.New York：Plenum Press，pp，1996.595-606.

3 Mohacsi PJ，Tuller D，Hulliger B，et al.Different inhibitory effects of immunosuppressive drugs on human and rat aortic smooth muscle and endothelial cell growth factor.JHeart Lung Transplant，1997，16：493-495.

4 Polyk K，Lee MH，Erdjument B，et al.Cloning of P27，a cyclin-depent kinase inhibitor and a potential mediater of extracellular antimitogenicsignals.Cell，1994，78：59-66.

5 Axel DI，Kunert W，Goggelmann C，et al.Paclitaxel inhibits arterial smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and in vivo using local drug delivery.Circulation，1997，96：636-645.

6 陈丹，吕安林，张薇，等.雷帕霉素-巴曲酶复合药物涂层支架预防支架内再狭窄的实验研究.心脏杂志，2007，19：185-188.

7 刁繁荣，吕安林，李军杰，等.雷帕霉素-替罗非班复合药物涂层支架预防支架内血栓和再狭窄的实验研究.心脏杂志，2007，19：384-387.

8 徐卫亭，霍勇，陈明，等.雷帕霉素和甲氨蝶呤涂层支架预防支架内再狭窄的实验研究.中国介入心脏病学杂志，2004，12：99-102.

9 陈津，陈纪言，李光.雷帕霉素-缬沙坦复方药物洗释支架预防支架内再狭窄的实验研究.岭南心血管病杂志，2002，8：421-424.

10 倪中华，易红，王跃轩，等.预防心血管再狭窄纳米颗粒载药涂层支架的研究.东南大学学报(自然科学版)，2004，34：789-793.

11 赵苏苏，张东生，卢勤.血管内药物涂层支架制备及应用的研究进展.东南大学学报(医学版)，2007，26：378-381.