东亚飞蝗血蓝蛋白亚基1基因的原核表达与蛋白结构预测

张新新，游婷，刘海霞，印红

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色［1］.节肢动物血蓝蛋白由6个相同或相似的分子质量在75ku左右的单体组成［2］.一个典型的节肢动物血蓝蛋白亚基分为3个结构域，第1个结构域包括N端的150～180个氨基酸，由6～7个α螺旋组成，并通过超二级结构形成稳定的螺旋束；第2个结构域为活性位点，由4个α螺旋束结合2个铜离子——CuA和CuB，每个α螺旋有3个His残基与Cu＋结合，这2个Cu＋为血蓝蛋白结合O2所必需；第3个结构域是C端，主要由β折叠结构组成，进一步折叠反平行的7股β桶超二级结构［3－4］.每个亚基的3个结构域在六聚体中有序排列.节肢动物血蓝蛋白属于一类蛋白质家族，其包括酚氧化酶（phenoloxidases，PO）、甲壳类假血蓝蛋白（crustacean pseudo－hemocyanins，又名cryptocyanin，PHc或Cc）、昆虫存储蛋白（insect storage hexamerins，Hx）、双翅类六聚蛋白受体（dipteran hexamerin receptors，HxR）［5］.血蓝蛋白作为三类呼吸功能蛋白之一，不仅承担着氧气传输的功能，而且它还具备能量储存和免疫防御功能［6－7］，血蓝蛋白在实验中显示出酚氧化酶活性，甚至可以转化为酚氧化酶［8－10］.此外，血蓝蛋白可以结合蜕皮激素而参与其在血淋巴中的运输［6，11］.研究表明，血蓝蛋白广泛存在于直翅目昆虫中，但目前相关研究非常少，迄今只有Sanchez等［12］在美洲沙漠蝗Schistocercaamericana的胚胎中调取了Hc1的部分序列，Yin等［13］获取了东亚飞蝗Locustamigratoria manilensisHc1的完整序列.东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis（Mey.）属于直翅目Orthoptera，蝗总科Aeridoidea，斑翅蝗科Oedipodidae，飞蝗属LocustaLinnaeus，是一种重要的农业害虫，是诱发蝗灾的一个重要的蝗虫种类［14］.本实验以东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis为研究对象，在获得其Hc1的cDNA完整序列和进行初步分析的基础上［13］，进而构建Hc1原核表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达系统中，SDS－PAGE电泳表明：经过IPTG诱导，目的基因可以高效表达［16］.同时预测了LmiHc1蛋白的高级结构，以期进一步探讨直翅目昆虫Hc1的功能和作用机理，进而为害虫的生物防治以及昆虫资源的开发利用奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

E.coliTrans1－T1，E.coliBL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司.原核表达载体pET－DsbA由河北大学柳峰松老师惠赠.东亚飞蝗由本实验室饲养.LATaq聚合酶、2 000u核酸分子质量标准、T4DNA连接酶（快速连接试剂盒）、BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒为Takara公司产品，异丙基硫代P－D－半乳糖苷（IPTG）为AMRESCO产品，质粒小量制备试剂盒、蛋白质Marker系TransGen产品，其他试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1LmiHc1基因的PCR扩增

取东亚飞蝗成虫1只，迅速解剖去内脏后用液氮冷冻组织，用TRIZOL法提取总RNA.RNA经过琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性以及是否有基因组DNA污染；经分光光度计测定其浓度.使用TransScriptTMFirst－Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）对RNA进行反转录反应获取cDNA.

根据已提交的LmiHc1基因核苷酸序列（GenBank：HQ213937），用Primer 5.0软件设计扩增LmiHc1部分基因的一对特异性引物F和R，F：5'－CGGCCTACAAGGCCAAGATGAG－3'（下划线为BamHⅠ酶切位点）R：5'－CCTTACACCTGCACCTCCTCGA－3'（下划线为HindⅢ酶切位点）.引物由上海生物工程技术服务有限公司合成.PCR扩增预计总长度为750bp.以东亚飞蝗cDNA为模板，F，R为引物扩增LmiHc1部分基因.PCR程序：94℃预变性3min；PCR扩增：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃终末延伸10min.10g／L琼脂糖凝胶电泳检测所扩增片段的正确性，胶回收试剂盒回收目的片段.

1.2.2 重组质粒的构建

用试剂盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0小量提取质粒pET－DsbA.质粒pETDsbA和目的基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收酶切片段，T4连接酶试剂盒作用下25℃连接2h，转化宿主菌，双酶切鉴定筛选出阳性克隆.挑取阳性克隆接种到LA（含100μg／mL氨苄青霉素）液体培养基中，大量增菌后，送往深圳华大基因科技有限公司测序.

1.2.3 pET－DsbA／LmiHc1融合蛋白的诱导表达

将测序正确的阳性重组子质粒分别转化表达宿主菌E.coliBL21（DE3）感受态细胞.筛选转化入重组质粒的表达宿主菌，将其接种于LB／Amp＋培养基中，37℃过夜震荡培养，然后取1mL过夜培养物接种于新培养基中，37℃220r／min继续培养至OD600≈0.6时，取1mL菌液于Eppendorf管中，离心弃上清液，收集菌体作为空诱导对照.在剩下的菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol／L，诱导3h，然后取1mL，离心弃上清液收集菌体沉淀，同时取空载pET－DsbA菌作为阴性对照.向沉淀中加入100μL 2×SDS上样缓冲液，混匀后沸水浴10min，各取5μL进行质量浓度为100g／L的SDS－PAGE电泳以检测目的蛋白的表达情况.

2 结果与分析

2.1 LmiHc1目的基因PCR的扩增

对东亚飞蝗cDNA片段进行RT－PCR扩增，PCR产物于10g／L琼脂糖凝胶电泳，约750bp处可见明亮的特异带，与预期条带大小相符，结果见图1.

2.2 LmiHc1基因及质粒双酶切纯化回收

pET－DsbA质粒与LmiHc1PCR扩增产物分别用BamHⅠ、HindⅢ双酶切，切胶回收后，经过10g／L琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小正确，且呈现单一条带，说明双酶切完全.

2.3 重组质粒鉴定

随机挑取6个重组转化的单菌落进行质粒提取，经过BamHⅠ、HindⅢ双酶切后电泳检测，重组质粒鉴定后都有750bp左右的目的片段，证明pET－DsbA／LmiHc1原核表达载体构建成功，选取1个质粒送测序公司进行测序.

图1 LmiHc1PCR产物Fig.1 PCR product of LmiHc1

2.4 重组融合蛋白LmiHc1的诱导表达

pET－DsbA／LmiHc1转化表达宿主菌BL21（DE3），经过IPTG诱导后，收集菌体沉淀经质量浓度为100g／L的SDS－PAGE电泳检测，结果可见相对分子质量25ku处有1条明显的蛋白条带，与预计的融合蛋白分子质量大小基本相符，同时作为对照组的pET－DsbA空载体也表达了分子质量约25ku的DsbA蛋白，电泳结果如图2所示.

3 Lmi Hc1蛋白的结构分析

通过前期工作获得LmiHc1的cDNA完整序列（GenBank：HQ213937）的分析［15］，LmiHc1基因全长为2271bp，包含1个2016bp的完整开放阅读框ORF和1个255bp 3'－UTR，PolyA尾上游15个核苷酸处存在典型的加尾信号AATAAA.

图2 大肠杆菌BL21（DE3）表达LmiHc1重组蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of LmiHc1expression of recombinant protein in E.coli BL21（DE3）

3.1 LmiHc1蛋白质一级结构分析

蛋白质一级结构（primary structure）是指多肽链的氨基酸残基的排列顺序，它是蛋白质最基本的结构.每一种蛋白质分子都有其特有的氨基酸组成和排列顺序，由此决定它的特定空间结构.

利用Signal P 3.0软件分析表明，LmiHc1基因编码的蛋白质N端有18个氨基酸的信号肽，成熟蛋白质含有654个氨基酸，理论分子质量为77.9ku，理论PI为6.06，负电荷残基（Asp＋Glu）94个（14.0%），正电荷残基（Arg＋Lys）82个（12.2%），疏水性氨基酸（A，I，L，F，W，V）有232个，约占34.5%；极性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）150个，占22.3%；在体外哺乳动物网状细胞中的估计半衰期为30h，在体外有机体内的半衰期大于20h，在大肠杆菌内的半衰期大于10h，蛋白的不稳定指数为44.82，属于不稳定蛋白（不稳定系数大于40的为不稳定蛋白质）；疏水性指数为82.93.

3.2 LmiHc1蛋白质二级结构分析

蛋白质二级结构（secondary structure）是指氨基酸残基形成的α螺旋（α－helix）、β折叠（β－sheet）、无规则卷曲（coil）以及基序（motif）等组件.

采用SABLE（http：／／sable.cchmc.org／）在线工具预测东亚飞蝗LmiHc1蛋白二级结构（图3）.结果显示，LmiHc1蛋白质结构为混合型，由α螺旋、β折叠与无规则卷曲组成.

3.3 LmiHc1蛋白质三级结构分析

基于查询序列与已知蛋白序列显著的相似性（相似度＞30%）预测其蛋白质三维结构的方法称为同源建模.Swiss－Model是通过完整的同源建模预测蛋白质三维结构的在线工具.其基本操作步骤如下：首先同源鉴定，Swiss－Model程序使用BLAST在PDB数据库中筛选出符合P值小于10－5（BLAST）及靶序列一致性不小于30%（SLM）的模板序列用于建模；然后，对所得的多模板进行结构比对，剔除不匹配模板；再根据模板序列与靶序列的局部一致性原理，由ProModⅡ确定其核心骨架以及环和侧链；最后用Gromos程序进一步优化能量.

采用Swiss－Model上提供的第1步模式（First Approach Mode）对LmiHc1蛋白序列进行建模（图4）.提交序列后返回结果显示：建模为24～669个氨基酸，参考模板为1hcyC，目标蛋白与参考蛋白的序列比对的一致性为43.19%，模型评估E值为0.00e－1.

图3 预测LmiHc1蛋白二级结构Fig.3 Secondary structure of LmiHc1

图4 预测东亚飞蝗LmiHc1蛋白三级结构Fig.4 Tertiary structure of LmiHc1

利用NCBI的CD search分析血蓝蛋白的结构域（图5），其中Query seq为LmiHc1氨基酸序列，Specific hits指特异性位点，Superfamilies指节肢动物血蓝蛋白超家族.结果显示LmiHc1含有节肢动物血蓝蛋白家族蛋白所具有的3个结构域：Hemocyanin＿N，Hemocyanin＿M，Hemocyanin＿C.其中Hemocyanin＿M为结合铜离子的结构域.

图5 LmiHc1蛋白结构域分析Fig.5 LmiHc1protein domain analysis

4 讨论

血蓝蛋白作为3大类呼吸功能蛋白之一，不仅承担着氧气传输的功能，而且还具备能量储存和免疫防御等功能，血蓝蛋白不仅在实验中显示出酚氧化酶活性，甚至可以转化为酚氧化酶；此外，血蓝蛋白可以介导蜕皮激素在血淋巴中的转运并参与调节蜕皮.近年来，血蓝蛋白的功能、作用机理、进化地位已经引起各国学者的浓厚兴趣，血蓝蛋白的新功能及其作用机理仍有待于进一步挖掘和深究.东亚飞蝗Locustamigratoria manilensis是中国飞蝗的3个亚种之一，中国史籍中的蝗灾，主要是东亚飞蝗，先后发生过800多次，分布于北纬42℃以南的东部季风区的平原地区，北起河北、陕西、山西，南达海南、广东、广西、云南，东至沿海各省及台湾，西至四川、甘肃南部［15］.为了研究东亚飞蝗血蓝蛋白的结构和功能，本文对东亚飞蝗血蓝蛋白亚基1插入合适的载体后导入大肠杆菌进行重组蛋白表达，并对蛋白质结构进行了预测，结果LmiHc1可以在大肠杆菌中正常表达，为进一步研究其蛋白结构和功能打下了基础，进而为害虫的生物防治以及昆虫资源的开发利用奠定理论基础.

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