猪流行性腹泻病毒ShT株的分离及传代培养

何 玲，唐满华，梁桂益，陈瑞爱，2

(1．广东大华农动物保健品股份有限公司，广东新兴 527400;2．华南农业大学兽医学院，广州 510642)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)为猪的常见易感病毒之一，对哺乳仔猪的危害最严重，感染后死亡率可达100%。我国以12月至次年2月为本病高发季节［1］，并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失［2］。PEDV适应细胞培养难度高，人工细胞培养很难获得成功。Hoffman等在Vero细胞的培养液中加入胰酶，才使得PEDV的细胞培养首次获得成功［3］，之后陆续有PEDV在Vero细胞中获得成功培养的报道。本实验将猪流行性腹泻病毒疑似病猪的粪便样品处理后在Vero细胞上连续传代，分离到一株猪流行性腹泻病毒，命名为ShT株，并对该病毒的培养特性、繁殖滴度进行了研究。

1 材料

1．1 病料 待检样品为粪便样，来自广东省某猪场疑似发生猪流行性腹泻的病猪。发病仔猪临床表现水样腹泻;死亡猪小肠段充满黄色液体，肠壁变薄。

1．2 细胞及培养试剂 Vero细胞由广东大华农公司技术中心生药研发室保存;胎牛血清、DMEM营养液购自 Hyclone公司，批号分别为 GWH0092，NXK0731;胰蛋白酶购自 GIBCO公司，批号为894452。

1．3 病毒鉴定引物 根据GenBank报告的PEDV N基因cDNA序列(accession NC003436)，设计2对引物，分别为套式PCR的外围引物和内围引物，扩增的目的片段长度分别为467 bp和221 bp。外围引物序列为:P1:5’－TATGTCTAACGGTTCTATTCCC－3’;P2:5`－CCTTATAGCCCTCTACAAGCA －3’;内围引物序列为:P3:5’－GGGCTAGCTTCCAGGTCAAC －3’，P4:5’－ CGTTACACCAGTTGGTGCTC－3’。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1．4 其他主要试剂 胶体金试纸卡Anigen Rapid PEDV Ag test Kit(RG14－01)由韩国BioNote公司生产。

PEDV与猪细小病毒(PPV)特异性阳性血清:由广东大华农公司技术中心生药研发室制备并保存。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(DV819A)、PrimeScript One Step RT －PCR Kit(DRR055A)、pMD20 － T Vector(D107A)、Premix Taq(D334)等购自宝生物工程(大连)有限公司;Gel Extraction Kit(DC3511－01)为Biomiga公司产品。RT－PCR反应总体积25μL，包含PrimeScript One Step enzymemix 1μL、2 × One Step Buffer 12．5 μL、RNA模板2μL，上下游引物(浓度为10μm/L)各2μL，灭菌水5．5μL。套式 PCR反应总体积25μL，包含 Premix Taq 12．5 μL，模板2 μL，上下游引物(浓度为10 μm/L)各2μL，灭菌水6．5 μL。

2 方法

2．1 病料的PCR检测 取待检粪样，4℃8000 g离心15 min，收集上清液;再用4层纱布过滤，收集滤出液，－70℃保存。采用氯仿－异戊醇方法提取病毒RNA，用设计的猪流行性腹泻病毒的外围引物按常规方法检测PEDV N基因，扩增条件为94℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，53 ℃复性30 s，72 ℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10 min。

2．2 病毒的分离 经PCR检测为PEDV阳性的样品12000 g离心10 min，取上清液以0．22μm无菌滤膜将含病毒的上清液过滤除菌。取24 h生长良好的Vero单层细胞，弃去培养液，按照10%接毒剂量接入上清液，即10 mL DMEM营养液中加入100μL病毒液。参考以往报道的文献资料添加胰酶至终浓度为0～60μg/mL。设置不接种病毒的含有相同浓度胰酶的细胞培养物作为阴性对照，置37℃5%CO2环境下培养，逐日观察，以48～96 h为一个传代周期，盲传3～4代。

2．3 细胞分离物的检测

2．3．1 套式PCR检测及序列测定 细胞培养物反复冻融3次后，采用氯仿－异戊醇方法提取病毒RNA，用外围引物按2．1的方法扩增猪流行性腹泻病毒的N基因。PCR产物1∶100稀释后，再用内围引物进行套式PCR扩增，扩增条件为94℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，54℃复性 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸7 min。将套式PCR扩增片段插入pMD－18T simple vector中，进行序列测定。将测序结果与GeneBank中公布的PEDV N基因核苷酸序列进行比对。

2．3．2 胶体金试纸卡检测 用韩国Anigen Rapid PEDV Ag test Kit检测。取培养至第27代和37代的病毒液100μL，加入装有1 mL反应缓冲液的样品收集管中，充分混匀;取出胶体金试纸卡，平放于宽敞和干燥的表面;用滴管向样品孔中缓慢并且精确地加入4－5滴混和液;反应进行时，会有紫色的条带在试纸中间的窗口中移动;5～10 min判断结果。

2．3．3 血清中和试验 采用固定病毒量稀释血清的方法。PEDV和PPV阳性血清由本实验室制备保存。PPV阳性血清作为阴性对照，DMEM液作为空白对照。

2．4 PEDV的培养特性

2．4．1 病毒的传代培养 将上一代的细胞培养物反复冻融3次，按2．2所述进行传代。整个传代过程期间，设置不接种病毒的含有相同浓度胰酶的细胞培养物作为阴性对照，逐日观察细胞病变效应。待出现明显病变时，按出现病变最早，最明显的培养条件继续传代。

2．4．2 病毒致细胞病变效应的特性 在倒置显微镜下观察并记录PEDV在Vero细胞上的CPE形成情况。

2．4．3 病毒的细胞感染滴度测定 在96孔细胞板上进行，每个稀释度接种8孔，每孔0．1mL，病毒稀释液为含有100μg/mL卡那霉素的DMEM。置37℃5%CO2环境下培养，逐日观察。根据细胞病变孔数按Reed－Muench法计算TCID50/0．1 mL。

3 结果

3．1 从粪便样和细胞培养物中扩增PEDV N基因的结果 对粪便样品进行RT－PCR检测，结果扩增出1条约为460 bp的DNA片段，其大小与预计片段理论值相符(如图1－A)。第8代病毒液用套式PCR扩增出1条约为220 bp的DNA片段，其大小与预计片段理论值相符(如图1－B)。分别将粪便样品的扩增片段和病毒液的套式PCR扩增片段插入pMD－20T vector中，进行测序。测序结果与GenBank中已公布的PEDV(accession NC003436)N基因核苷酸序列相似度达99%以上。

图1 PEDV PCR鉴定结果

3．2 胶体金试纸卡检测 培养至第27代和37代的病毒液10倍稀释后滴入试纸卡的样品孔中，质控线(C线)出现紫色条带，检测线(T线)出现淡淡的紫色条带，表明病毒液中含有PEDV，且其毒价不低于104TCID50/0．1 mL，因为此试纸卡的检测灵敏度为 104TCID50/0．1 mL。

3．3 血清中和试验 血清中和试验表明分离获得的病毒能被PEDV阳性血清中和，而不能被PPV阳性血清中和。进一步证实Vero细胞分离物中存在PEDV，命名为PEDV ShT株。

3．4 病毒的细胞培养特性 盲传至第4代时出现细胞病变，第5代病变已非常明显，以后随着传代次数的增加，CPE逐渐增加，并且出现的时间缩短，表现为细胞肿胀、变圆，颗粒物质增多，折光性增强和培养后期细胞的大量脱落(如图2)。

图2 接种PEDV的Vero细胞产生的病变

3．5 病毒的细胞感染滴度 取用Vero细胞培养至第20代，25代、30代的病毒液，测其细胞感染滴度，病毒稀释液为含有100μg/mL卡那霉素的DMEM。结果，其 TCID50/0．1 mL 分别为 10－7．0、10－7．13、10－7．33。

4 讨论

国内有关猪流行性腹泻病毒分离鉴定的报道不少［4－5］，但是病毒的分离条件、培养增殖条件不尽相同。例如，钱永清等［6］将病毒在 Vero细胞上盲传5代后，转入Marc145细胞上培养，维持液为含一定胰酶的1640培养液，盲传至第7代出现细胞病变。本试验采用Vero细胞、含胰酶的DMEM分离到一株猪流行性腹泻病毒(PEDV ShT株)。病毒盲传第4代时就观察到细胞病变，表现为细胞肿胀变圆，折光性增加，颗粒物质增多，培养后期出现细胞的大量脱落。

用含胰酶和不含胰酶的DMEM作为稀释液测PEDV ShT株的细胞感染滴度，两者获得的结果相差甚远。因此，认为PEDV的细胞培养物毒价的比较和评定不能单纯比较数值多少，还应清楚取得该数值的测定方法与条件。另外还可以借助胶体金检测卡、动物实验等方法来辅助评价病毒细胞培养物毒价的高低。

PEDV的体外细胞适应难度大，繁殖条件复杂，病毒在细胞培养中繁殖滴度低，一直是PEDV体外增殖过程的一个重要技术瓶颈，直接影响了PEDV的生物学特性基础研究和实践中相关生物制品的发展［7］。研究中的PEDV ShT株能在Vero细胞上稳定生长，产生的病变也十分明显。结合PEDV ShT株病料来源的感染猪的临床症状及其细胞培养特性来看，其很有希望成为一较好的疫苗株。但是其能否真正成为猪流行性腹泻病毒疫苗的种毒候选株，还需要后续对其免疫原性和稳定性进行试验研究。

［1］ 殷 震，刘景华．动物病毒学(第二版)［M］．北京:科学出版社．1996:688－690．

［2］ 倪艳秀，林继煌，何孔旺，等．猪流行性腹泻研究概况［J］．畜牧与兽医，2001，33(1):38 －40．

［3］ Hofmann M，Wyler R．Propagation of the virusof porcine epidemic diarrhea in cell culture［J］．JClin Microbiol，1988，26:2235 －2239．

［4］ 张桂红．猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03株分离鉴定［D］．黑龙江哈尔滨:东北农业大学，2008．

［5］ 钱永清，闻人楚，唐永兰，等．猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定［J］．上海农业学报，1999，15(2):41 －44．

［6］ 钱永清，苏万国，何锡忠，等．从上海郊区新分离到一株猪流行性腹泻病毒［J］．上海畜牧兽医通讯，2003，6:15．

［7］ 毛雅元，张桂红，葛俊伟，等．猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03株分离及培养特性［J］．病毒学报，2010，26(6):483－488．