鸡血浆中黄芩苷及绿原酸的HPLC法建立

孙 博，李继昌，王小飞，王凤霞，覃晓林，孙美成，代重山

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

慢呼抗口服液是由黄芩、金银花、百部、紫菀、甘草五味中药组成的中药复方制剂，主要用于治疗鸡毒支原体病，具有扶正祛邪、杀菌、清热解毒、润肺止咳、增强机体免疫力等功效［1］。黄芩与金银花在方剂中是关键组分，二者的主要成分分别为黄芩苷和绿原酸。目前，慢呼抗口服液的药代动力学研究尚不明确，缺乏可靠的药理学研究数据，限制了慢呼抗口服液在临床中的应用。由于高效液相色谱法(HPLC)检测技术在药代动力学研究中已经成熟，分析技术及实验方案的合理性对最终目标会产生相应影响，并且使用内标法同时测定多味中药的两种成分还不常见，故本文建立HPLC法测定慢呼抗口服液中黄芩苷和绿原酸在鸡血浆中的浓度，以期为药代动力学研究提供参考。

1 材料

1．1 仪器 Waters高效液相色谱仪、Kromasil C18色谱柱(4．6 mm ×150 mm，5μm)、Nova－Pak C18 Guard－PakTM保护柱、SPD－10AVP紫外检测器、离心机、旋转蒸发仪、超声仪、电热恒温水浴锅、分析天平、超声清洗仪、漩涡混合器、真空干燥箱、微孔滤膜、注射器。

1．2 药品及配制

1．2．1 药品 对照品黄芩苷(Baicalin，BC，批号MUST－11101403)、对照品绿原酸(Chlorogenic acid，ChA，批号 MUST －11042802)、内标物葛根素(Puerarin，Pr)、色谱甲醇、色谱乙腈、超纯水，其他试剂均为分析纯，中药复方制剂自制。

1．2．2 试剂的配制 对照品溶液的制备:分别精密称取对照品黄芩苷及绿原酸各2 mg，用色谱甲醇定容于同一个10 mL容量瓶中，经超声处理20 min后取出，放至室温，加流动相至刻度，摇匀，高速离心(3000 r/min)取上清，4℃冰箱保存待用，使用前稀释成相应浓度。取内标物葛根素2 mg，用色谱甲醇定容于10 mL容量瓶中，处理方法同上。慢呼抗口服液的制备:黄芩、金银花、百部、紫菀、甘草五味中药按照质量比为3∶2∶2∶2∶1的比例水提醇沉，60℃旋蒸至100mL药液，含生药量为1 g/mL，4℃冰箱保存。

1．3 实验动物 海兰雏鸡5只，1日龄购入，雌雄兼有，笼养，自由采食、饮水。临床上无疾病症状，饲养期间温度控制在(25±2)℃，自由采食及饮水，饲料为普通全价日粮。至4周龄时进行试验。

1．4 空白血浆制备 翅下静脉取血约10mL，放入肝素化的离心管中，3000 r/min离心10 min，分离血浆，取上清，放置－20℃冰箱备用。

2 方法与结果

2．1 色谱条件的建立 流动相A相:乙腈、甲醇，B相:1%冰醋酸、10%磷酸;检测波长根据《中华人民共和国药典》选择，黄芩苷和绿原酸检测波长分别为280、327 nm［2］。色谱条件如表1。柱温25℃;进样量10μL。如图1，峰形良好，各成分能完全分离。

2．2 血浆样品处理方法 分别配制浓度为4、50、160μg/mL和2、40、150μg/mL的黄芩苷及绿原酸混合对照品溶液，每个浓度平行操作5次［3］。放入40℃真空干燥箱，残渣加入300μL空白血浆，加入内标物50μL，漩涡1 min。加入以下三种溶液800 μL，1、高氯酸;2、V(甲醇)∶V(乙腈)=3 ∶1;3、正丁醇;漩涡1min，离心(3000 r/min)，前两者分别取上清800μL于干净EP管中，55℃真空干燥;正丁醇处理后取醇层，减压回收。残渣分别加入200 μL流动相，漩涡1 min，超声10 min，过0．22 μm微孔滤膜，10μL进样［4］。以上三种方法为高氯酸法、甲醇乙腈法、正丁醇法。提取回收率结果见表2。由表2可知，甲醇乙腈法测得黄芩苷的平均回收率为84．8%，RSD值＜4．8;绿原酸的平均回收率为85．9%，RSD值＜4．3%，并且用正丁醇法处理各个峰的分离度较差，因此，甲醇乙腈法处理血浆简单、快捷，为最佳提取方法。

表1 流动相梯度变化程序表

表2 黄芩苷及绿原酸在鸡血浆中提取回收率(n=5)

2．3 血浆处理方法学考察

2．3．1 专属性考察 慢呼抗口服液进样后色谱图1;取300μL空白血浆，按照2．2项甲醇乙腈法处理后的色谱图2;空白血浆添加标准品按照2．2项甲醇乙腈法处理后的色谱图3;取给药后血浆样品，按照2．2项甲醇乙腈法处理后的色谱图4。结果表明，黄芩苷、葛根素、绿原酸的保留时间分别为10．2、12．6、24．0 min。内标物葛根素及待测物黄芩苷、绿原酸完全分离，峰形良好，血浆中内源性物质不会干扰样品的测定。

2．3．2 标准曲线 分别配制 0．1、2、10、50、80、160 μg/mL浓度的黄芩苷、绿原酸标准溶液。分别加入浓度为10 mg/mL的内标溶液50μL，55℃真空干燥。残渣加入0．3 mL空白血浆，按照2．2项下甲醇乙腈法处理后，取10μL进样［5］。记录色谱图，计算黄芩苷峰面积A1、绿原酸峰面积A2和内标峰面积AIS的比值得相应回归方程(Y=A/AIS)，Y1=0．6724x+0．1793，R=0．999;Y2=0．1725x+0．0551，R=0．9997。黄芩苷及绿原酸方法最低检测限分别为0．12、0．2 μg/mL。

2．3．3 精密度及准确度测定 分别配制浓度为4、50、160 μg/mL 和2、40、150 μg/mL 的黄芩苷及绿原酸血浆样品。按所建立的方法平行操作5次;按所建立的方法，每天一次，连续5 d。分别求出对照品与内标物峰面积比，代入各自的标准曲线得出相应浓度，求出日内、日间精密度及相对回收率和准确度［6］。由表3可知黄芩苷与绿原酸日内精密度均＜5%，日间精密度＜9%，说明血浆样品分析方法精密度和准确度良好，符合有关规范要求。

表3 黄芩苷及绿原酸在鸡血浆中精密度和准确度(n=5)

2．3．4 稳定性测定 取对照品及内标物，反复进样5次，考察仪器稳定性，得黄芩苷、绿原酸、葛根素含量RSD 分别为1．6%、1．2%和1．5%;取血浆样品浓度为50μg/mL的黄芩苷及绿原酸混合溶液，按 2．2 项中甲醇乙腈法处理，与 0、2、4、6、12、18、24 h分析测定血浆中药物含量，考察室温放置24 h样品的稳定性，得黄芩苷和绿原酸含量RSD分别为1．8%和2．0%;取血浆样品浓度为50μg/mL的黄芩苷及绿原酸混合溶液，反复冻融3个循环测定血浆样品从－20℃至室温的冻融稳定性，黄芩苷和绿原酸含量RSD分别为7．2%和5．0%。

3 讨论

3．1内标物选择及HPLC方法建立 内标法能减小误差，使结果更准确。中药复方成分比较复杂，因此在选择内标物时，要避免与复方中其他成分及血浆中内源性物质峰型相互干扰［7］。根据黄芩苷及绿原酸的结构，选择结构式相近化合物并结合HPLC预试来筛选。芦丁出峰时间为18．2 min，与复方中成分峰重叠，因此选择葛根素作为内标物。流动相选用甲醇时，色谱峰拖尾，并且成分不能完全分离，故流动相选用乙腈。经过预试，梯度洗脱时间在A:5%(0 min)～37%(30 min)，峰形良好，分离完全，对有效成分测定无干扰。

3．2 血浆处理方法 药代动力学血浆样品的预处理，一般用蛋白沉淀或萃取的方法。除去血浆中蛋白有多种试剂可供选择，但在处理样品之前应了解该方法是否会导致生物样品中的药物发生分解或影响药物提取率以及破坏药物酸碱性等。加入高氯酸可使蛋白质形成不溶性盐而析出，甲醇、乙腈是沉淀蛋白常用有机溶剂，黄芩苷和绿原酸都含有羟基和羧基，呈弱酸性，极性较大，因此，在除蛋白的过程中要防止使用碱性溶液或被空气氧化。在沉淀蛋白前充分漩涡或离心，以防止提取药物被蛋白包裹。

3．3 血浆处理方法学考察 通过对甲醇乙腈法专属性、加样回收率、线性关系、精密度、准确度及稳定性的考察可以看出，该检测方法及处理方法可以作为中药复方慢呼抗口服液的药代动力学研究方法，并且对该药物的进一步研究具有指导意义。

［1］ 陈少萍．绿原酸药代动力学研究进展［J］．中成药，2010，32(4):645－648．

［2］ 中华人民共和国国家药典委员会．中国药典一部［M］．北京:化学工业出版社，2005:598－599．

［3］ 肖崇厚．中药化学［M］．上海:上海科学技术出社，1987:327－328．

［4］ 孙丽荣，严华成，曹 雄，等．不同血浆样品制备方法对芍药苷血液药物浓度测定的影响［J］．中国药物与临床，2008，8(11):846－848．

［5］ 居文政，刘 芳，吴 婷，等．UPLC－MS/MS法同时测定人血浆中黄芩苷和绿原酸［J］．药学学报，2007，42(10):1074－1077．

［6］ 高 荣．银黄注射液和银黄口服液在大鼠体内的药动学－药效学研究和代谢组学初步研究［D］．成都:四川大学，2007．

［7］ Natalie L．Use of fingerprinting and compounds for identification and standardization of botanical drugs:strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products［J］．Drug Inf J，1998，32(4):497 －512．