结核疫苗研究进展

刘珊珊，韩文瑜，雷连成，冯 新，孙长江，姚翠梅，高 宇，赵红蕾

(吉林大学农学部畜牧兽医学院，长春 130062)

我国属结核病高流行地区，结核病人数居全世界第二位，是全球22个结核病高负担国家之一。世界卫生组织早在1993年宣布“全球结核病紧急状态”。卡介苗(BCG)是牛型结核分枝杆菌强毒株经13年传代培养获得的减毒株，于1921年首次使用。自从1974年世界卫生组织正式将其列入免疫接种计划以来，已经有约40亿剂的卡介苗得到接种。目前卡介苗仍是唯一的结核疫苗，长期的临床应用验证其免疫效果大约在接种10～15后年逐渐减弱，对儿童以及青少年的保护性受到限制。临床试验也证实，BCG免疫不能对成年人提供良好的保护效果，更无法预防潜伏性结核感染。因此，临床上迫切需要新的疫苗来控制结核病的发生发展。

结核疫苗研究的关键是对结核分枝杆菌(MTB)的致病机制有深入了解。MTB致病机理复杂，主要是诱导机体细胞免疫，因此结核病不能像其他疾病一样应用传统疫苗免疫手段得以有效控制，同时也不能用传统免疫血清学方法进行有效诊断，目前为止在疫苗研制和检测方面均未得到突破性进展。基于此，各国均在加大投入对结核病进行广泛深入研究。本文对结核疫苗研制进展进行了阐述。

1 抗结核感染相关免疫反应

了解MTB感染免疫机制有利于合理设计抗结核疫苗。MTB是胞内感染菌，因其独特的蜡质细胞壁结构，对于可溶性抗菌成分显示出强烈抵抗作用，而肺泡内吞噬作用显得尤为重要，机体抗MTB感染主要依赖细胞免疫应答，是一类T细胞介导的、以巨噬细胞为主要效应细胞的免疫反应，包括巨噬细胞吞噬MTB、抗原递呈、T淋巴细胞对抗原的特异性识别结合、抗原增殖和分化、免疫细胞释放相应细胞因子、巨噬细胞激活和杀菌等。调节性免疫反应对于结核感染至关重要，能够提供长期的免疫保护以防止疾病复发。MTB潜伏感染后在机体免疫力下降的情况下常常会发生疾病复发甚至进入急性感染期。可以说机体免疫反应的强度很大程度上决定了带菌感染者一生的健康。全世界每年20亿结核感染者中，只有10%会发展为活动性结核，而剩下的90%无疑因为患者本身完善的免疫系统将疾病得以控制［1－2］。而免疫反应对于控制结核的有效作用在结核共感染HIV得到另一个方面的证实:共感染患者中一生中10%可能发展为活动性肺结核的几率扩增到1年内就有10%可能发展为活动性肺结核［3］。

1．1 抗结核感染相关细胞免疫反应 MTB进入机体后被肺吞噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞吞噬，后者将抗原处理后递呈给MHC限制性T细胞［4］。MHC II分子将抗原递呈给CD4+T细胞，而CD4+T细胞辅助细胞分化成不同亚群，激发产生相应细胞因子，通常产生IFN－γ、IL－2和TNF－α来进一步激活巨噬细胞。而MHC I类分子将相关抗原递呈给CD8+T辅助细胞，进而分化成IFN－γ和TNF－α来激活巨噬细胞［5］，因MTB表面富含补体受体，感染部位濒死的巨噬细胞吸引着单核细胞和其他免疫细胞从而形成局部损伤。IFN－γ信号同时还能促进吞噬体和溶酶体的融合，从而达到抵抗MTB的作用。IFN－γ对于抵抗结核等胞内感染是必不可少的，因其能激活巨噬细胞，并产生毒性分子从而杀死MTB。激活的巨噬细胞分泌诸如TNF－α，IL－12，IL－18等细胞因子。TNF－α对于诱发其他炎症趋化因子和相应受体是非常有效的，因此TNF－α和IFN－γ是关键细胞因子，能促进感染性吞噬过程同时也作为评价TH1反应的标准［6－7］。而 TNF－α 本身作为一个效应因子可以协同IFN－γ来激活记忆T细胞是机体预防细胞内病原菌再次感染的基础。而IL－2的共表达对于抵抗病毒感染从而保护宿主而显得尤为重要(图1)［8－9］。MTB 在巨噬细胞和 DC 细胞中得以存活，对于结核的有效控制主要依靠巨噬细胞和T细胞亚群［10］，诱导记忆T细胞产生是高效疫苗必备条件。

图1 抗MTB感染相关的T细胞亚群［8］

1．2 抗结核感染相关体液免疫反应 针对MTB产生的抗体，由于无法接触到胞内菌体，只能对释放出巨噬细胞的细菌发挥作用，因此体液免疫反应只能起到辅助抗感染作用。体液免疫反应对于抗结核感染的作用仍没有得到充分了解，最初研究中发现B细胞缺失的小鼠相对于野生鼠并未显示出高易感性。然而近期研究不断发现，在这些B细胞缺陷小鼠中，MTB滴度和因聚集过多的中性粒细胞而出现的病理损伤相对高于野生菌［11］。而抗体在某些情况下对于抵抗MTB感染显示一定作用，在肺结核开放期，MTB因表面具有宿主抗MTB抗体从而改变其吞噬细胞内化机制，使巨噬细胞趋化作用提高，增强其吞噬溶酶体作用而有效杀死MTB。

1．3 MTB是通过气溶胶形式传播感染 多数病灶集中在感染者肺部，因此有效地开发区域黏膜免疫从而控制结核传播显得意义深重。一些研究已经验证了黏膜免疫对于抗结核感染的显著作用［12－13］，而该免疫反应通常涉及较为复杂的免疫机制，包括先天免疫、体液细胞免疫等，同时分泌到肺部黏膜的抗菌肽抗菌机制也参与其中。

2 结核疫苗研制策略

为了减少全球结核病的广泛蔓延，不断研发新的疫苗策略，以期达到对成年人和儿童都能提供优于BCG疫苗的免疫保护作用。主要研发策略见图3。后续疫苗不仅能够控制最初感染，而且能够减少MTB的复制代谢活性，从而将其引入休眠期［14－15］。因此，合适的感染后疫苗也是研发的热点，尤其在高感染率地区，这样的疫苗显得尤为必需。

图3 结核疫苗研发策略［11］

2．1 重组BCG疫苗和减毒活性结核疫苗 重组BCG疫苗是将一些重要抗原尤其是MTB表面蛋白相关毒力因子导入BCG菌株，如存在于BCG缺失区域RD1、RD2等一些具有高度免疫活性抗原基因，从而得到一个重组BCG疫苗，以期能取代传统BCG 疫 苗，如 rBCGΔureC:Hly(VPM1002)和rBCG30目前已经进入临床前期。而MTB减毒活疫苗是敲除MTB的一些基因从而得到基因缺失突变株，MTB减毒活疫苗因其能够表达多种抗原从而能激活多功能T细胞群亚群，显示出较强的免疫活性。减毒活疫苗比BCG具有更好的保护作用和安全性［16－17］，目前主要的结核重组疫苗以及减毒活疫苗见表1。而其他一些减毒疫苗期待在未来几年内陆续进入临床前期，主要目标设置在基因敲除方面，比如MTBVAC01疫苗是通过敲除转录调控子phoP相关毒力基因而构建的［18］。

表1 MTB重组疫苗和减毒疫苗［16］

2．2 亚单位疫苗和活载体疫苗 对MTB亚单位疫苗研究起源于20世纪80年代，研究发现只有活的MTB才能够提供免疫保护作用，而死菌则不能，原因在于死菌中缺乏一些毒力因子，而这些毒力因子常常是一些分泌蛋白，并且通过实验证实，这些分泌蛋白往往通过佐剂能够刺激机体产生强烈的免疫反应［19－20］。尽管随着蛋白组学发展，不断更新新的方法来分析MTB早期培养滤液，将近有100多种新的表面蛋白被发现［21］，但目前主要亚单位疫苗候选抗原仍集中在少数几个蛋白上，如Ag85B、ESAT－6和CFP－10等，显然目前对于亚单位疫苗候选基因筛选工作只做了很小的一部分，大量工作等待我们去开展。目前MTB亚单位疫苗主要有两种类型，一种是由2～3个MTB主要毒力相关蛋白构成;另一种是表达一个或是多个MTB蛋白的活载体疫苗。重组蛋白疫苗需要相关佐剂辅助来刺激产生Th1型免疫反应，而活载体疫苗则不需要相关的佐剂，目前研发的活载体疫苗能产生类似BCG免疫相关的免疫保护作用，甚至有些对于灵长类动物显示出良好的免疫保护作用［22］。Ag85B－ESAT－6、Ag85B －TB －10．4(H4，AERAS－404)、M72、MVA85A、Ad35(AERAS －402)等都是这两个类型的候选疫苗［23－26］，有的也进入临床一期。活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫苗设计新思路，将痘病毒修饰后做为DNA载体来重组重要抗原，联合BCG和禽痘重组Ag85A疫苗能激发出比BCG更强的免疫保护力。r－MVAAg85疫苗已经进入临床一期阶段。利用鼠伤寒沙门氏菌减毒株作为载体，将编码MTB保护性抗原基因导入其中，可构建重组st疫苗，如rst－Ag85B;而将保护基因导入小鼠巨噬细胞或骨髓细胞则可构建结核活细胞疫苗，如J774－HSP65疫苗。目前主要的结核亚单位疫苗见表2。

表2 MTB亚单位疫苗［24］

2．3 DNA疫苗 向宿主体内注射DNA载体使宿主通过自身包装表达机制来表达DNA载体中融合蛋白，从而避免了使用佐剂的副作用，这些抗原通过递呈MHC I类相关分子，而诱导CD4+和CD8+T细胞免疫反应得到广泛关注［27－28］。结核 DNA疫苗研究领域中 Ag85家族研究最为广泛，其中Ag85A活性最强［29］。有研究甚至建立多价 DNA疫苗，融合 Ag85B、ESAT － 6、KatG、MPT8．4、MPT12、MPT63、MPT64 和 MPT83 蛋白［30］。目前主要的结核DNA疫苗见表3。

表 3 MTB DNA 疫苗［31］

有研究发现，分泌蛋白对于诱导DNA疫苗有效的保护作用是必需的，同时这种DNA疫苗对于高致病性耐药临床结核分离菌株有高效的保护作用［31］。Ag85A DNA疫苗也可以作为免疫增强剂，甚至是细胞因子刺激剂来提高机体免疫力。比如在给小鼠免疫BCG之前给予Ag85A DNA疫苗免疫，保护效果从单独BCG免疫的0．67log到联合免疫后的 1．12log，保护效果显著增强［32］。有研究还将IL－12基因融合到Ag85A DNA疫苗中，从而将Ag85A DNA保护效率提高到与BCG免疫效果相当［33］。DNA疫苗的应用除了本身的安全问题，我们还必须考虑到这种类型疫苗是否可以应用到人类身上，而病毒编码Ag85A疫苗对于BCG免疫的增强效果在人类身上也得到证实，这无疑是个好的开始，DNA疫苗对于人类至少可以成为有前景的免疫增强剂，而对于这种疫苗本身的恐惧并不足以抹杀其对人类免疫提高的显著作用。

2．4 灭活疫苗 灭活菌体疫苗感染相关疾病的危险性相对较小，目前结核疫苗研制在这个领域主要采取两个策略，一是灭活BCG载体疫苗，二是选用一些其他分枝杆菌载体，如热灭活弱毒性分枝杆菌如Mycobacterium vaccae，具有安全性同时还能作为抗结核的免疫治疗剂，而灭活Mycobacterium vaccae疫苗已经完成临床3期安全实验。临床试验显示，这类型疫苗能够提高放射疗法和化学疗法的疗效，大大缩短治疗时间［33］。

2．5 佐剂研发 佐剂的功能在过去疫苗研制过程中有所忽视，最近很多研究表明佐剂除了可以增强疫苗免疫原性(如DC靶向提呈)，促进免疫细胞分化成熟，还在诱导免疫应答倾向(Th1或Th2)，甚至改变特异性T细胞克隆群等过程中都发挥了重要作用，这对于抗结核感染显得意义重大。在过去的几年里，实验验证了一些佐剂作为结核疫苗有效佐剂所具备的有效性和安全性［35］，其中单磷酸酯质A(MPL)被广泛应用，尤其与DNA疫苗联合使用时显示更强的保护作用，而新一代的氨基烃基类MPL佐剂的药效研究正积极展开。目前在结核疫苗研制领域由此也掀起了一场开发新型佐剂的激烈战。

2．6 未来结核疫苗研究方向 未来结核疫苗研究主要着重两个方向，一是感染后疫苗，靶向潜伏期MTB，以期来完全消灭潜伏期MTB，或是降低其复制感染几率，从而控制疾病的复发，而潜伏表达相关抗原就成为该类疫苗的候选基因［36］。另一个方向就是开发BCG免疫增强剂，以期增强BCG免疫效果，而筛选的增强剂候选基因必须是能完全消灭MTB的相关抗原，而不是仅仅将其靶向潜伏期。

3 新的疫苗评价标准

对于疫苗评价主要是针对已经进入临床前期的相关疫苗(表4)，通过深入了解MTB相关免疫机制和致病机理，我们必须考虑到这些疫苗的有效性和安全性。有效性至少要比BCG强，安全性至少可以用于HIV高流行地区，而具体的评定标准见表5。

表4 处于临床阶段的结核疫苗及其接种方法［36］

表5 结核疫苗评价标准［36］

4 展望

随着来自公共基金、政府机构和各项社会投资的增加，MTB致病机理、疫苗研发、疾病诊断等方面研究的不断深入，预计在2015年以前会有20种左右新结核疫苗进入临床一期试验，到2015年会获得一种有效、安全、廉价的新结核疫苗，得以在全球广泛使用。我们有理由相信，经过数代科学家们持之以恒的努力，到2050年有可能达到控制和逐步消灭结核病的伟大目标［37］。

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