儿童口服液对小鼠免疫功能的影响

黄生权，甘海宁，赖焕玲

儿童口服液由枸杞子、茯苓、香菇、山楂、金针菇、红枣等10余种药食同源的中草药配伍，针对少年儿童生长发育过程中的生理特点，运用现代高新技术精制而成，富含多种氨基酸、维生素及微量元素可提升儿童抵抗力，均衡儿童所需营养，增强儿童体质。本实验观察了儿童口服液对小鼠免疫功能的影响，现将实验结果报道如下。

1 材料

1.1 受试药物

儿童口服液，由无限极（中国）有限公司提供，批号：12J16A01A-A；茯苓多糖口服液，湖南补天药业有限公司，批号：20120602。

1.2 主要试剂、仪器

环磷酰胺，山西普德药业股份有限公司，批号：04120704；DNCB，广州齐云生物科技有限公司，批号：0168B383；丙酮，天津大茂化学试剂厂，批号：20110414；蓖麻油，天津市耀华化学试剂有限责任公司，20100205；RPMI1640培养液，Thermo，批号：NXJ0699；小牛血清，GIBCO，批号：8122818；分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，EL204；恒温水浴箱，上海精宏实验设备有限公司，DK-420S；全波长酶标仪，Thermo Fisher Scientif i c Oy，1510。

1.3 动物

KM小鼠，SPF级，合格证号：SCXK（粤）2008-0020，由广州中医药大学实验动物中心提供。

2 方法

2.1 对免疫器官重量的影响

灌胃给予受试样品（0.2 mL/10 g），每天1次，连续30 d。正常对照组和模型组给予等容积蒸馏水。于实验前5 d，除正常对照组外，其余各组腹腔注射环磷酰胺（50 mg/kg/日），连续3 d。末次给予受试样品1 h后，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称重，计算脏器系数。

2.2 溶血素抗体含量测定

灌胃给予受试样品（0.2 mL/10 g），每天1次，连续30 d。正常对照组和模型对照组给予等容积蒸馏水。实验前5 d，除正常空白对照组外均腹腔注射环磷酰胺（50 mg/kg/日），连续3 d。试验第24 d，各组腹腔注射绵羊红细胞（0.2 mL/只），免疫6 d后，眼眶取血，分离血清进行溶血素含量的测定。

绵羊红细胞（SRBC）的制备：两倍体积液阿氏液（Alsever）与一倍体积绵羊红细胞混匀，置于4℃冰箱中保存备用。临用时取上述保存的绵羊红细胞，用生理盐水洗涤3次，每次2000 rpm，5 min，弃上清液，再用生理盐水3:5稀释。

补体制备：取豚鼠8只，心脏采血，离心分离血清，-20℃保存，临用时生理盐水1:10稀释。

溶血素测定：取小鼠血清，用生理盐水500倍稀释。各组样品管中分别加入1:500小鼠血清1 mL、1:10补体血清1 mL、以及稀释10%SRBC 0.5 mL混匀，另取空白管，分别加入等量的补体、SRBC及1 mL生理盐水。然后各管于37℃水浴锅中水浴10 min后，冰浴10 min终止反应，2000 rpm离心10 min，取上清液，以空白管调零，在可见光分光光度计540 nm处测定各管OD值。记录结果，进行统计学处理。

2.3 对迟发超敏反应的影响

灌胃给予受试样品（0.2 mL/10g），每天1次，连续30 d。空白对照组和模型组给予等容积蒸馏水。实验前5 d，每只小鼠腹部去毛，范围约3 cm×3 cm，将含5%DNCB的丙酮麻油溶液(1:1,V/V)50 μL均匀涂抹致敏，次日强化1次；小鼠致敏后立即腹腔注射环磷酰胺125 mg.kg-1诱导小鼠降低的DTH反应。致敏5 d后，用5%DNCB丙酮麻油溶液10 μL均匀涂抹于各组小鼠右耳内外两面进行攻击，左耳涂抹等量无DNCB的丙酮麻油溶液。攻击24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，于耳片外侧2/3部分用打孔器取下直径8 mm的耳片，置电子天平称重，以左右耳片重量之差作为肿胀度。记录结果并进行统计学处理。

2.4 对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

灌胃给予受试样品（0.2 mL/10g），每天1次，连续30 d。正常对照组和模型对照组给予等容积蒸馏水。实验前5 d，除正常对照组外，其余各组腹腔注射环磷酰胺（50 mg/kg/日），连续3 d。末次给予受试样品1 h后，由小鼠尾静脉注入50%印度墨汁生理盐水溶液（0.1 mL/10g），在注入墨汁后30 s及6 min从小鼠眼眶取血，用移液枪取25 μL，立刻吹入2 mL Na2CO3（0.1%）溶液中，于该溶液中吸入、吹出数次以充分洗出吸管壁附着之血液。再取25 μL空白小鼠血置于2 mL0.1% Na2CO3溶液中作为校准，于可见分光光度计675 nm处测定吸光度。脱颈椎处死小鼠，取肝脏和脾脏精密称重，按下式计算吞噬指数K、吞噬系数（校正吞噬指数）α。记录结果，并进行统计学处理。

（式中C为血中碳粒浓度即吸光度；T为时间（min）；W为体重（g）；WLS为肝脾合重（g））

2.5 NK细胞活性测定

灌胃给予受试样品（0.2 mL/10g），每天1次，连续30 d。正常对照组给予等容积蒸馏水。末次给予受试样品1 h后处死动物，取脾进行实验。①小鼠脾细胞悬液的制备方法同前，细胞浓度为5×106个/mL。②靶细胞：传代培养的L929细胞在实验前一天换液，实验时用0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化1～2 min，加完全1640培养液，轻轻吹打细胞使其完全从壁上脱落，1000 rpm离心5 min，倾去上清液，将沉积细胞重悬于含10%小牛血清1640培养液中，调细胞浓度至1×105个/mL即为备用的靶细胞。③NK细胞活性的测定：向96孔平底塑料培养板每孔中分别加入靶细胞悬液（0.1 ml/孔）,然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱内培养4 h，使靶细胞贴壁成一单层细胞，实验组每孔加入0.1 mL效应细胞(使效靶细胞比例为50:1)，每样品做3个复孔，靶细胞对照孔加1640培养液0.1 mL，再放置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养20 h，倾去上清液，用生理盐水轻轻灌满各孔，以除去效应细胞及被杀伤而脱落下来的靶细胞，重复3次，在滤纸上吸干孔内水分，每孔加入0.1 mL中性红染液（0.1%），37℃培养30 min，弃去染液，再用生理盐水洗3次后，每孔加入0.1 mL细胞溶解液（醋酸：乙醇=1:1)，使吞有中性红的靶细胞溶解，释放出中性红，轻轻震荡使分散摇匀。用酶标仪在492 nm处测定OD值。按照如下公式计算杀伤率即为NK细胞活性。结果进行统计学处理。

2. 6 统计方法

所有实验数据均以x±S表示。计量数据采用SPSS 17. 0 统计软件进行方差分析及组间检验。P < 0. 05有统计学意义。

3 结果

3.1 儿童口服液对小鼠免疫器官重量的影响

表1 儿童口服液对免疫器官重量的影响（x±S）

3.2 儿童口服液对小鼠血清溶血素含量的影响

表2 儿童口服液对溶血素抗体含量的影响（x±S）

3.3 儿童口服液对小鼠迟发超敏反应的影响

表3 儿童口服液对环磷酰胺降低小鼠DTH反应的影响（x±S）

3.4 儿童口服液对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

表4 儿童口服液对单核-巨噬细胞功能的影响（x±S）

3.5 儿童口服液对小鼠NK细胞活性的影响

表5 受试品对NK细胞活性的影响（x±S）

4 讨论

胸腺和脾脏都是重要的免疫器官，其中胸腺是T细胞分化、成熟的场所，其功能状态直接决定机体的细胞免疫水平，并间接影响体液免疫功能。脾脏是免疫细胞定居的场所，也是免疫应答的场所，可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用[1]。体液免疫是机体特异性免疫的重要组成部分，负责体液免疫的细胞是B细胞。B淋巴细胞在抗原刺激及Th细胞辅助下，最终分化成能产生抗体的浆细胞。抗体形成细胞数量的多少可反映机体体液免疫的水平[2]。迟发型变态反应是由于机体T2淋巴细胞受抗原刺激后，分化为特异性的致敏T2淋巴细胞，当致敏T2淋巴细胞再次接触相同的抗原后，引起迟发型超敏反应，使T2淋巴细胞活化，释放出多种淋巴因子，产生炎症，炎症反应的程度反映了机体对该抗原特异性细胞免疫力的大小[3]。单核巨噬细胞系统在机体的特异性和非特异性免疫中亦发挥重要作用，如直接吞噬、杀伤病原体和肿瘤细胞，产生免疫调节因子等，显示出非特异性免疫作用[4]。NK细胞是一类重要的免疫调节细胞，是机体细胞免疫功能的组成部分，NK细胞能非特异性地杀伤靶细胞（主要是某些肿瘤细胞和病毒感染细胞），因此，NK细胞在肿瘤免疫、抗病毒感染中具有重要作用，已公认其在免疫监视中为最重要的效应细胞[5]。

本实验的结果表明，儿童口服液可显著升高免疫功能低下小鼠的脾脏系数、胸腺系数, 增加血清中溶血素抗体的含量，提高免疫抑制小鼠迟发超敏反应强度，增加单核-巨噬细胞的吞噬能力，提高小鼠NK细胞的活性，提示儿童口服液能够提高机体免疫功能。

[1] 沈关心.微生物与免疫学[M].北京:人民卫生出版社,2003:17.

[2] 李仪奎. 中药药理实验方法学(第二版)[M].上海:上海科学技术出版社,2006:159.

[3] 徐叔云.药理试验方法学(第三版)[M].北京:人民卫生出版社,2001:1420.

[4] 刘艺萍.巨噬细胞的抗肿瘤效应[J].国外医学•免疫学分册,1998, 21(4): 207.

[5] 王蒙.自然杀伤细胞的抗病毒活性[J].免疫学杂志, 2003,19(2):154.