LPS温控凝胶实验性角膜基质炎动物模型的创建

宗方伟，郝筱诗，郝继龙

（吉林大学中日联谊医院 眼科，吉林 长春130033）

临床上，角膜炎症是导致视力丧失的主要致盲原因。其致病机理复杂，感染性和免疫性因素相互交织，外在毒力和机体固有免疫反应互相影响；其诱发原因多样，细菌、真菌、病毒以及其代谢产物等。角膜炎症的动物模型对于研究其复杂的致病机理至关重要，是临床和科研上不可或缺的研究工具。一直以来，角膜基质炎的动物模型最普遍的建立方法为基质内注射，或者是菌液，或者是提纯的致病因子，例如内毒素脂多糖。此方法沿用以久，最早可追溯到1986年，很多炎症反应中的作用机理因此被发现［1，2］。然而，此种方法有一种主要的缺陷，即是其炎症反应不够严重和持久。其原因一方面是由于实验动物例如兔子等草食性哺乳动物由于其自然生活的习性，具有较强的创伤愈合能力。此外还有一个主要原因是注射的水溶液由于角膜内皮泵的作用很快的被代谢掉，不能长久的存留，其作用效果自然也不能持久［2－7］。因此，对于科研人员而言，很难用这种动物模型系统长久的进行机理性等观察研究，例如在评价某些药物的药效及副作用时。客观上，需要一种能够更为严重且持久的角膜炎症动物模型。本实验中，我们设计了一种含有脂多糖的温控凝胶，能够原位存在，缓释、持久的诱导炎症反应。此凝胶具有温度敏感性，在低温时候是液态，当温度升高，能够迅速转化为高粘滞性的凝胶。因此，可以以水溶液的形式很轻易的注射进角膜基质内，注射后又能够成为凝胶长久存在。我们期待利用此种方法能够建立起令人满意的动物模型。

1 材料和方法

1．1 实验动物及造模过程

本实验采用新西兰成年雄性白兔，体重2－2．5千克（北京大学动物中心提供）。本实验的动物使用及处理符合视觉与眼科研究协会（ARVO）动物保护伦理规范。利用氯丙嗪与异丙嗪（1∶1，200μl／kg）肌肉内注射麻醉实验动物［4，6］，麻醉后平置于拓普康眼科手术显微镜下。考虑到动物伦理因素，每只实验动物仅使用其右眼。各个时间点的10只兔子随机均分为两组，用29G的微量注射器从角膜的周边穿至中央，基质内注射LPS温控凝胶或传统的水溶液10μl，以角膜轻度隆起及注射区基质变白为注射成功标志［2，7］。造模24小时后，开始实验观察，并对角膜大体相及HE染色计数评分。

1．2 预实验

尽管泊洛沙姆的生物相容性及安全性已经被广泛认可，但为了证明其本身不会对角膜的炎症反应产生影响，在预实验中，我们首先设计了不含LPS的单纯18%泊洛沙姆凝胶进行基质内注射，观察14天。

预实验：经过连续14天的观察，注射泊洛沙姆空白凝胶后的角膜一直维持透明，无任何炎症反应。证明泊洛沙姆凝胶本身有很好的生物相容性，不会引起或对角膜的炎症反应产生影响，亦即不会对脂多糖的作用产生影响。

1．3 角膜大体相的评分标准及临床观察

造模后的1、3、7、14天，两组动物模型在眼科手术显微镜下进行角膜炎症浸润及新生血管情况的照相及评分。其评分标准如下：

【角膜炎性浸润】

0分 — 完全透明无混浊

1分—轻度混浊

2分 — 中度混浊，仍可透见虹膜纹理

3分 — 重度混浊，不能看清虹膜纹理，但仍可见虹膜

4分 — 极重度混浊，不能透见虹膜

【新生血管评分】

0分 — 角膜缘无新生血管

1分 — 小于1／4象限角膜缘出现新生血管，轻度充盈

2分 —1／4至1／2象限角膜缘出现新生血管，轻度充盈，或小于1／4象限角膜缘出现新生血管，但重度充盈

3分 —1／2至3／4象限出现新生血管，轻度充盈，或1／4至1／2象限角膜缘出现新生血管，但重度充盈

4分 — 全角膜缘出现轻度充盈新生血管，或大于3／4象限角膜缘新生血管重度充盈

5分—一至三个象限的角膜缘新生血管蔓延至角膜中央区，严重充血怒张

6分 — 接近全周边的新生血管长入角膜中央，严重充盈充血

1．4 HE染色及炎性细胞计数

各时间点动物模型在角膜大体相照相后过量麻醉致死，迅速取下眼球，常规方法固定，取下角膜做冰冻切片，包埋于OCT中。切割7μm厚的角膜冰冻切片，半小时风干，室温下丙酮固定30分钟，PBS冲洗后，常规方法行HE染色。病灶区域内炎症细胞在400倍的显微镜视野下行细胞计数。

1．5 统计学分析

所有的资料数据按均数±标准差表达，独立样本T检验分析，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2．1 角膜炎性浸润及新生血管

对比于传统方法的LPS水溶液，LPS温控凝胶显示出明显的持久、缓释的特性。连续14天的观察结果下，其建立了更加严重、持久的角膜基质炎症动物模型。

造模1天后，两组间动物模型的炎症对比无明显差别，甚至，某些传统LPS水溶液组的角膜炎症反应甚至要轻度重于LPS凝胶组，这可能是因为LPS在水溶液中弥散较快，在角膜基质中更早的诱发炎症反应。尽管如此，在此后的3、7、14天的观察中，LPS温控凝胶组的炎症反应均明显严重于对照组。在造模3天后，对照组的角膜炎症虽然也较前有所加重，但LPS凝胶组的炎症反应加重更为明显，相当部分的角膜出现了环行的灰白色浸润，初起时仅是以弧形出现，后逐渐弥漫至环形，并开始自旁中央向角膜中央迁延。在造模7天后，对照组的角膜炎性浸润大部分已消失，仅在角膜缘周边残留不同程度扩张的新生血管，且此新生血管均未延伸至中央。而在LPS凝胶组，角膜的炎性浸润仍持续性加重，逐渐变成瓷白色混浊，不能透见虹膜。在3天时出现的弧形浸润继续加重，互相融合，并开始延伸至中央。相应的，其新生血管的差异也十分明显。实验组的新生血管粗大、充盈，随着炎症的进展自周边迁延至中央。造模14天后，由于药效的时限性和哺乳动物（兔子）对创伤的愈合反应逐步恢复，两组动物模型的角膜炎性浸润均已明显减轻。所不同的是，对照组的角膜几乎已完全恢复透明，而实验组仍可见到轻度的混浊。尽管如此，在角膜残存的新生血管上，仍可明显看出两者的不同。对照组的新生血管较少，仅限于角膜缘，且枝干都较细小，几乎无充盈；而实验组的新生血管粗大、充血，互相融合，大面积的向中央区延伸。

表1 角膜炎性浸润的评分 （均数±标准差，n＝5）

表2 角膜新生血管的评分（均数±标准差，n＝5）

2．2 HE染色炎性细胞计数

角膜基质的炎性细胞数量反应了角膜炎症的严重程度。在不同时间点的角膜组织切片炎性细胞计数结果，基本上和上述宏观的大体相结果相对应。在造模1天后，两组角膜切片中的炎性细胞数无明显差异（P＞0．05），仅有少量炎性细胞出现，大部分是粒细胞。而在此后的3、7、14天时间点上，两组的结果便出现了显著的差异。LPS凝胶组的炎性细胞数远远的高于对照组（P＜0．01）。在造模14天后，对照组的角膜切片中，炎性细胞数已基本上回降至正常水平，而实验组仍有大量炎性细胞存在，尽管跟第7天时对比已经明显下降。此结果显示角膜大体相炎症程度和新生血管评分的差异性，代表了两组动物模型在炎症反应和免疫反应程度上的差异。

表3 角膜切片HE染色炎性细胞计数 （均数±标准差，n＝5）

3 讨论

角膜的炎性浸润是导致视力障碍的最为重要原因之一，尤其是在发展中国家，角膜盲仅次于白内障，位居致盲疾病的第二位。在角膜炎的病理进程中，角膜基质层的炎性反应是最为重要的一方面。感染性因素和机体的免疫相关因素相互影响，导致炎症的不断进展、恶化，例如角膜基质内基质金属蛋白酶类在炎症进程中的激活导致了基质纤维不断溶解，排列紊乱，其结果是角膜失去了原来的透明性，视力严重丧失。细菌的内毒素脂多糖已被证明是主要的毒力因子，在既往的多次实验中已被证实［1，3，8－10］。也因此，借助于 LPS诱导角膜的炎症反应成为科研上常用的方法之一。

3．1 内毒素的基质内注射

目前为止，有很多种方法建立角膜炎症的动物模型，例如深层纵向的切割、角膜上皮的刮除、角膜缝线法以及基质内注射等。众多方法中，基质内注射的方法最为常用，因为其可最小程度上造成额外创伤，保持上皮细胞的完整性，对于研究单纯的角膜基质层的反应机理较为重要（额外干扰因素最少）。角膜基质层的改变被证实是外来的感染性毒力因素和自身免疫反应的结果。尽管如此，此方法造成的基质炎动物模型不够严重和持久，注射的水溶液被内皮泵迅速代谢，难以长久发挥作用，给科研和临床上的研究带来了困难。

3．2 泊洛沙姆温控凝胶

泊洛沙姆作为一种惰性的高分子材料，其生物相容性非常好，作为助溶的佐剂已经在某些学科上应用于临床，用于肌肉、血管内注射，某些药物的缓释剂型。在眼科领域，已有些研究人员尝试将其配制进滴眼液，用以加强其粘附性［11－13］。本实验中，我们利用其温度敏感性的特性，制作成LPS凝胶进行角膜基质内注射，使原本不易存留的脂多糖得以持久、缓释的作用，取得了令人满意的效果。

3．3 角膜的炎性浸润环

本实验的LPS凝胶组中，很多动物模型出现了角膜的炎性浸润环。最初是较小的、不完整的弧形浸润，随着炎症进展逐渐发展成环形，且自周边开始向角膜中央蔓延，最终导致了角膜的大片瓷白色混浊。相应的，新生血管也随之长入中央。此动态过程清晰可见，反复出现于凝胶组的多例动物模型中，具有一定的代表性，而从未出现于传统的LPS水溶液组中。在之后的角膜切片染色中，发现此环形的浸润主要为中性粒细胞。我们推测此浸润环的出现是由于中央区注射的LPS不断诱导的炎症反应和免疫反应的结果。中央区刺激原的持续存在，激活了角膜基质层内信号传导通路等介质的释放（如NF－KB途径等），持续性的吸引中性粒细胞移行，自周边向刺激源聚集，由弧形的浸润灶融合成环形，自周边蔓延至中央。借助于改良的LPS凝胶，我们可以清晰的、动态的看到这一全过程。

总而言之，本实验借助于创新性的LPS温控凝胶，对传统的脂多糖水溶液基质内注射方法进行了改良，建立起了更为严重且持久的动物模型，取得了较为满意的效果，为今后的科研工作提供了一定的方便。

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