IL－6抗原抗体干预对T2DM大鼠肝脏IL－6mRNA表达的影响

陈 雨，郑少雄，孟春梅，郝 杰

（天津医科大学第二医院 内分泌科，天津300211）

T2DM的病因可归结为胰岛β细胞分泌胰岛素缺陷和胰岛素作用障碍。炎症或免疫因素是胰岛素抵抗和β细胞功能衰竭的重要原因，大量的免疫炎症介质参与了上述过程，其中，关于IL－6的作用一直是一个引起争议的话题。本研究旨在探讨炎症因子IL－6在T2DM发病机制中的作用。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 健康雄性SD大鼠36只，平均体重254±7．5g，购于北京大学医学部实验动物中心。

1．1．2 主要试剂 高糖高脂乳剂（脂肪乳）；链脲佐菌素 （STZ）；IL－6 抗 原、抗 体；Trizol试 剂、Oligo（dT）18、dNTP、目的基因引物 DNA、内参基因引物DNA、逆转录酶。

1．2 方法

1．2．1 T2DM 大鼠模型的建立，IL－6抗原、抗体的干预及标本留取 按体重随机分为4组：N组（正常对照组，10只），A 组（糖尿病IL－6抗原组，10只），B组（糖尿病IL－6抗体组，8只），C（糖尿病对照组，8只）。均普通饲料喂养。A、B、C三组连续7周按1ml／100mg体重／d给予脂肪乳灌胃，N组按同样剂量给予水灌胃对照，之后称取动物体重，按30mg／kg体重尾静脉注射STZ。3天后，血糖测定结果大于16．7mmol／L为T2DM造模成功。造模后继续普通饲料喂养和脂肪乳灌胃（0．5ml／100mg体重／d）。成模后第2天，A组给予IL－6抗原稀释液（10 μg／ml）腹腔注射0．6ml／只／d，连续干预5天；B组给予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，连续干预4天，第5天IL－6抗体液（1mg／ml）腹腔注射0．6ml／只；C、N组均给予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，连续干预5天。四组大鼠均于成模后第7天处死。采集标本：剪尾测血糖，股动脉取血，称重，并取肝脏液氮保存。

1．2．2 血糖及胰岛素测定 罗氏血糖仪每周检测血糖1次；血清胰岛素采用液相平衡竞争放射免疫分析法测定。

1．2．3 按照试剂盒说明，采用双抗体夹心ELISA法测定血清IL－6；提取大鼠肝细胞膜，按照试剂盒说明，采用固相夹心ELISA法测定肝组织细胞膜上胰岛素受体（InsR）。

1．2．4 肝脏组IL－6mRNA表达 Trizol提取肝脏细胞总RNA，后经逆转录反应，合成cDNA，对其进行PCR扩增。采用的引物序列及反应参数如下：IL－6，上游：5’－AACTCCATCTGCCCTTCA－3’，下游引物：5’－GGTCCTTAGCCACTCCTT－3’。反应参数为94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃终末延伸10min，扩增片段长度588bp；内 参 基 因 β－actin，上 游：5’－CACCCGCGAGTACAACCTTC－3’，下游：5’－CCCATACCCACCATCACACC－3’，反 应 参 数 为 94℃ 5 min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃终末延伸10min，扩增片段长度232bp。用SYNGENE全自动凝胶成像分析系统对IL－6和内参β－actin的RT－PCR产物各条带灰度进行图像采集，计算IL－6／β－actin的比值，进行半定量分析。

1．3 统计学处理 应用SPSS11．5软件包处理行统计分析，数据用¯x±s表示，组间比较采用方差分析；采用Pearson相关系数评价IL－6抗原、抗体与血糖、胰岛素等指标的相关性。

2 结果

2．1 一般情况 普通饮食饲养并辅以脂肪乳灌胃，7周后与对照组相比，糖尿病A、B、C组血清胰岛素升高明显（20．10±10．02，20．45±7．94，19．46±5．94vs11．57±5．85）（P＜0．05），7周时，各组大鼠体重的比较均无统计学差异。实验结束时，糖尿病A、B、C组体重较对照组降低明显（309．90±20．75，303．75±39．26，319．75±20．53vs410．60±22．37）（P＜0．05）；糖尿病A、B、C组血糖较对照组仍升高明显（24．03±6．93，23．80±1．67，21．93±1．56 vs5．50±0．42）（P＜0．05）。

2．2 肝细胞膜InsR、血清IL－6的变化 与N组比较，A、B、C组大鼠肝细胞膜胰岛素受体水平升高（7．09±4．93，7．03±4．97，6．84±4．65vs4．39±3．09）（P＜0．05）；与B、C、N组比较，A组大鼠血清IL－6水平明显升高（1058．89±223．97vs404．34±60．33，411．72±126．17，407．43±88．52）（P＜0．05）。

2．3 IL－6抗原抗体干预前后对胰岛素相关指标的影响

2．3．1 IL－6抗原及IL－6抗体等干预前后各组的血糖结果比较 见表1。A、B、C三组干预后较干预前血糖下降明显（P＜0．05），但对各组内干预前后血糖的相关性分析显示，二者无相关关系（P＞0．05）。表明IL－6抗原、IL－6抗体、PBS的干预对糖尿病大鼠的血糖没有影响。

表1 干预前后各组组内的血糖变化

2．3．2 IL－6抗原及IL－6抗体等干预前后各组的胰岛素结果比较 见表2。B、C二组干预后较干预前胰岛素下降明显（P＜0．05）；而与干预前相比，A组干预后的胰岛素水平下降，无统计学意义（P＞0．05）。对各组内干预前后胰岛素的相关性分析显示，仅B组经IL－6抗体干预，前、后胰岛素水平有相关性，相关系数r＝0．759（P＜0．05）。表明，IL－6抗体的干预能够使糖尿病大鼠的胰岛素水平降低。2．4 RT－PCR 检测各实验组大鼠肝脏组织IL－6 mRNA的结果 外源性给予IL－6抗原干预，使A组大鼠肝脏的IL－6表达增加，仅与B组比较差异有统计学意义（P＜0．05）；见表3、图1。表明外源性给予IL－6抗原、抗体对大鼠肝脏组织的IL－6mRNA表达有影响。

表2 干预前后各组组内的胰岛素变化

表3 各组大鼠肝脏组织IL－6mRNA表达

图1 大鼠肝脏组织IL－6mRNA RT－PCR扩增电泳结果

3 讨论

胰岛素抵抗和β细胞功能障碍是T2DM发病的两大机制。然而胰岛素抵抗也可以同样程度的存在于许多无糖尿病人群中，因此单独的胰岛素抵抗不可能是T2DM的决定性致病因素。更多的事实表明，胰岛特别是胰岛β细胞的异常可能是T2DM发病的中心环节［1－2］。

近年来，一些临床流行病学的研究发现T2DM患者血循环中的急性期反应产物和炎症因子水平升高，存在自然免疫的激活和低度炎症［3］；而且抗炎治疗可以改善T2DM患者糖代谢异常、提高胰岛素敏感性。

IL－6产生于多种不同类型的细胞，肝脏的IL－6主要由Kupffer细胞、内皮细胞分泌，并以旁分泌方式作用于肝细胞［4］，它既能刺激肝细胞合成急性期反应蛋白，又能引起再生反应，其作用主要通过IL－6受体活化细胞内一系列信号蛋白分子来实现。目前的研究现状表明，IL－6是炎症所导致的代谢综合征的罪魁祸首。有研究报道，IL－6缺乏的大鼠血糖水平升高并有糖耐量减低，雌性大鼠的血脂升高［5］。Senn等［6］研究发现，IL－6能抑制胰岛素信号转导及胰岛素作用。Rotter等研究发现，短时间（120分钟）注射IL－6对大鼠肝脏、肌肉、脂肪的胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化无影响［7］。Klover等［8］在对小鼠注射IL－6第5天时发现，血浆IL－6升高6倍，与肥胖状态下IL－6水平相似（升高2－4倍）。另外，小鼠肝脏STAT（signal transducer and activator of transcription，信号转导子和转录激活子）磷酸化增加，胰岛素受体磷酸化下降60%，IRS－1和IRS－2磷酸化分别降低60%和40%。IL－6亦使葡萄糖激酶mRNA转录降低约40%，糖耐量试验提示胰岛素敏感性降低。Klover等［9］在对Lep ob小鼠注射IL－6中和抗体后发现，与对照组相比，IL－6缺乏的Lep ob小鼠胰岛素受体自身磷酸化及蛋白激酶激活分别增加35%及50%，高胰岛素正常血糖钳夹试验中，内源性葡萄糖生成抑制是对照组的2．8倍。这说明IL－6缺乏的小鼠胰岛素敏感性有所改善，反映了IL－6在肝脏IR中的作用。

我们的实验取T2DM大鼠的肝脏组织，在经过IL－6抗原、抗体等干预后，应用RT－PCR技术测定IL－6mRNA的表达，结果显示，经IL－6抗原腹腔注射的糖尿病大鼠肝脏IL－6mRNA的表达明显高于IL－6抗体腹腔注射组，但与糖尿病对照组及正常对照组之间的升高没有统计学的意义，这表明IL－6抗原及IL－6抗体对于肝脏的炎性细胞因子表达有一定作用，即IL－6抗原可能能够刺激肝脏的Kupffer细胞、内皮细胞等分泌IL－6，IL－6抗体也可能对抑制肝脏IL－6mRNA的表达起到不可忽视的作用。

同时，血清中的IL－6水平采用ELISA法测定也显示IL－6抗原干预组较其他组明显升高，而IL－6抗体腹腔注射的糖尿病大鼠与PBS腹腔干预的糖尿病和正常对照组大鼠之间没有明显差别，可以认为IL－6抗体的腹腔注射对于血清中的IL－6表达没有显著作用，而IL－6抗原的腹腔注射则会显著增加血循环中IL－6的水平，但其具体机制还有待于进一步研究。此外，本实验显示IL－6抗体的干预能够使糖尿病大鼠的胰岛素水平降低。

采用ELISA法测定肝细胞膜上InsR，结果显示糖尿病不同干预组间比较无统计学差别，仅有糖尿病组较正常组升高明显。其机制可能与T2DM大鼠胰岛素在肝脏作用减低，胰岛敏感性下降，代偿性引起高胰岛素血症和肝脏胰岛素受体表达增加有关。

综上，本实验证实了慢性低水平炎症是T2DM的发生发展的重要机制，IL－6等炎症因子或免疫因素促使胰岛素抵抗和β细胞功能衰竭。另外，本实验存在可以改进的的地方，即造模前后脂肪乳灌胃剂量一致，可保证大鼠的持续高胰岛素血症、胰岛素抵抗状态、胰岛素敏感性降低。因此，从另一角度而言，IL－6缺乏可能对T2DM大鼠胰岛β细胞功能具有一定保护作用。慢性低水平炎症在T2DM病生理过程中的重要地位，为今后T2DM病理机制研究和防治提供相应理论依据。

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［6］Senn JJ，Klover PJ，Nowak IA，et al．Interleukin－6induces cellular insulin resistance in hepatocyte ［J］．Diabetes，2002，51（12）：3391．

［7］Rotter Sopasakis V，Larsson BM，Johansson A，et al．Short－term infusion of interleukin－6dose not induce insulin resistance in vivo or impair insulin signalling in rat［J］．Diabetologia，2004，47（1）：1879．

［8］Klover PJ，Zimmers TA，Konians LG，et al．Chronic exposure to interleukin－6causes hepatic insulin resistance in mice［J］．Diabetes，2003，52（11）：2784．

［9］Klover PJ，Clementi AH，Mooney RA，et al．Interleukin－6depletion selectively improves hepatic insulin action in obesity［J］．Endocrinology，2005，146（8）：3417．