半边莲多糖的微波提取工艺研究※

卫 冰 杨 云 刘 炯 张 杰 张华锋

（河南中医学院药学院，郑州450046）

半边莲为桔梗科植物半边莲药材 （Lobelia chinensis Lour.）的干燥全草。主要分布于中南、东南及西南等地［1］。具有清热解毒、利水消肿之功效。常用于痈肿疔疮，蛇虫咬伤，鼓胀水肿，湿热黄疸，湿疹湿疮等症［2］。现代研究表明半边莲全草所含化学成分主要为生物碱、多糖、黄酮苷、皂苷、氨基酸、延胡索酸等成分［3］。目前对半边莲药材的研究对集中于半边莲生物碱的抗肿瘤活性［4］，而对于半边莲多糖的研究则鲜有报道，现有的研究业已表明植物多糖具有较好的生物活性，如免疫活性和抗肿瘤活性等，因此有必要对半边莲多糖进行的系统的研究，用以填补该方面的空白。基于此本文对半边莲多糖的微波提取工艺进行了研究，为其多糖的开发利用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 药材 半边莲药材购于河南郑州张仲景大药房，经河南中医学院生药教研室董诚明教授鉴定为中药半边莲（Lobelia chinensis Lour.）干燥全草。

1.2 仪器 岛津UV－1800紫外可见分光光度计 （尤尼柯上海仪器有限公司）；MettlerAE 240十万分之一精密天平 （瑞士Mettler公司）；Sartorious BS224S万分之一精密天平 （北京赛多利斯公司）；水浴锅 （巩义市峪予华仪器厂）；旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）；离心机 （LD25－2型）；XJA－100A型高速粉碎机 （姜堰市银河仪厂）。

1.3 试剂 无水葡萄糖 （天津市科密欧化学试剂开发中心）；苯酚、硫酸等均为分析纯。

1.4 多糖含量测定方法的建立

1.4.1 葡萄糖标准品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品50.02mg，置100ml容量瓶中，加水溶液稀释至刻度，摇匀，做储备液备用，浓度为500.2ug／ml。

1.4.2 苯酚液的制备 称取苯酚100g于烧瓶中，加入NaHCO30.05g和铝片0.1g，放置于冷凝回流装置体系，收集182℃馏分。称取此馏分2.5g加水溶液中定容于50ml棕色容量瓶中即得5%苯酚溶液，避光、密封冷藏备用。

1.4.3 测定波长的选择 精密吸取标准品2.0ml，置于20ml试管中，另取2.0ml蒸馏水置于20ml试管中，作为空白溶液。分别加1.0ml饱和苯酚溶液、5ml浓硫酸溶液显色，摇匀，室温放置40min后，于290～900nm进行全波长扫描，由扫描结果可知，标准品均在490nm处有最大吸收，故确定490nm为测定波长。

1.4.4 方法学考察

1.4.4.1 线性关系的考察 精密量取葡萄糖储备液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5ml于25ml容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀，得葡萄糖浓度分别为20.02、30.03、40.04、50.05、60.06、70.07μg／ml 的 标 准 溶 液。按“1.4.3”项下操作，在490nm处测定光度，结果见表1。以溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程为标准曲线方程是y＝0.0148c＋0.0403相关系数r＝0.9995。表明，葡萄糖浓度在20.02～70.07μg／ml；范围内呈良好的线性关系。

1.4.4.2 精密度考察 取浓度为50.06μg／ml的葡萄糖标准溶液2.0ml，依照 “2.4.1”项下测定吸光度，连续测定5次，计算吸收度的RSD值为0.07%，表明仪器精密度良好。

1.4.4.3 重现性实验 同50.06μg／ml糖溶液6份，按“2.4.1”项下处测定吸光度，测定糖含量，计算吸收度的RSD为1.49%，表明该方法重现性良好。

1.4.4.4 稳定性实验 取浓度为50.06μg／ml的的葡萄糖标准溶液2.0ml，每隔20min依照 “1.4.4.1”项下测定吸光度，连续测定2h，其RSD值为0.54%，表明样品在2h内具有良好的稳定性。

1.4.4.5 回收率实验 精密称取样品多糖 （糖含量为22.76%）6份，每份约2.8mg分别加入葡萄糖标准液（浓度为124.83μg／ml）5ml，定容至25ml容量瓶中，各溶液取2.0ml，依照 “1.4.4.1”项下测定吸光度，计算回收率，得平均回收率为96.94%，RSD＝3.32%，结果见表1。

表1 回收率实验结果 （%）

1.4.5 评分标准 本研究采用加权评分法综合评估［5］，半边莲多糖提取条件将各项指标除以该列最大值再乘以100，为该项得分。经处理，多糖得率和含糖量均转化为0～100之间的数值。再根据多糖得率 （a）和含糖量 （b）作用，而确定两者的权重系数均为0.5，对这两项指标进行加权求和，通过公式M＝0.5a＋0.5b，就得到综合评分 （M）。其中，多糖利率 （%）＝多糖质量／药材质量×100%，多糖含量＝c×d／m×100%。

其中c为根据标准曲线回归方程求得的浓度（μg·ml－1）；d为稀释倍数；m为干燥后所得粗多糖的质量（mg）。

2 结果

2.1 微波功率的选择 称取6份半边莲药材粗粉，每份10g，料液比1∶30，分别在80、240、400、560、720、800W不同微波功率下，提取半边莲多糖20min，提取2次，合并滤液，以下常规水提取工艺下操作，结果以800W为最佳提取功率。

2.2 微波提取时间的选择 称取半边莲药材粗粉6份，每份10g，料液比1∶30，分别在10、20、30、40、50min不同提取时间下，提取微波功率800W，提取2次，合并滤液，以下步骤水提取工艺下操作，结果以50min为最佳的提取时间。

2.3 微波提取次数的选择 取半边莲药材粗粉5份，每份30g，料液比1∶30，波提取功率为800W，每次20min，分别提取1、2、3、4、5次，合并滤液，其余步骤按常规水提取工艺操作，结果以提取三次效果最佳。

2.4 正交实验 选择提取温度、料液比、提取时间及提取次数为4个考察因素，每个因素选取3个水平，按L9（34）正交表安排实验，每个实验均平行两份，正交因素水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 半边莲提取正交试验安排

表3 L9（34）正交试验表 （n，%）

表4 显著性检验

结合表3和表4，可以看出各因素影响大小顺序为A＞C＞D＞B，最佳工艺方案为A1B2C1D2，即取半边莲粗粉，加入30倍量水，560W微波提取30min，提取3次。

2.5 验证实验 按A1B2C1D2工艺提取，考察此工艺的稳定性，做3组平行试验，结果得多糖平均得率为25.87% （RSD＝2.3%），多糖平均含量为60.13% （RSD＝3.1%），均高于正交表中的实验结果。

3 讨论

3.1 粒度与浸泡时间的选择 研究初曾考察了药材的三种粒度：过1号筛、2号筛及1cm小段，对多糖提取率和多糖含量的影响，也考察了药材粉末的浸泡时间对多糖提取率和含量的影响，得到过1号筛，浸泡0h的综合评分最高。

3.2 微波提取方法的选择 微波提取有两种可行方式［6－7］，一种是全程均用微波提取，而另一种是以微波预处理药液，继以传统水提取方式提取多糖。预实验曾以半边莲多糖常规水提取最佳工艺为对照，初步比较该两种方法优劣，发现全程用微波提取的评分高。

3.3 常规水提工艺 实验之初，曾检阅了大量有关多糖水提的文献［8－10］，确定常规的水提工艺为：加20倍水量（水体积：药材质量），100℃水浴回流2h，3次，合并滤液，浓缩至1∶2（药材质量：体积），80%醇沉过夜，依次用无水乙醇，丙酮，无水乙醚洗涤离心，挥干乙醚，即得多糖。

［1］谢若男，周建理.半边莲的生药鉴定［J］.安徽中医学院学报，1999，18（3）：51.

［2］邓可众，熊英，高文远.半边莲的化学成分研究［J］.中草药，2009，40（8）：1198－1200.

［3］姜艳艳，石任兵，刘斌，等.半边莲药效物质基础研究［J］.中国中药杂志，2009，34（3）：294－297.

［4］姜艳艳，石任兵，刘斌，等.半边莲中黄酮类化学成分研究［D］.北京中医药大学学报，2009，32（1）：59－61.

［5］董晶晶，李晓坤，杨云，等.首乌藤多糖酶法提取工艺研究［J］.中国现代应用药学，2011，28（6）：519－523.

［6］许海燕，杨义芳，黄春跃.微波提取黄芪中多糖的工艺研究［J］.中草药，2008，39（1）：1496－1499.

［7］孙萍，兰卫，李艳，等.微波提取肉苁蓉中总黄酮和多糖的含量测定［J］.中草药，2003，34（6）：98－112.

［8］许小华，杨云，张寒娟，等.正交试验法优选墨旱莲多糖的水提工艺研究［J］.中国现代应用药学，2010，27（4）：319－322.

［9］杨云，冯卫生，孟江，等.正交试验法优选大枣渣多糖水煎煮提取工艺［J］.中药新药与临床药理，2003，3：200－202.

［10］邓庆华.用正交试验法优化金银花多糖提取工艺［D］.长春：东北师范大学，2008：96－110.