紫外诱变酿酒酵母筛选耐高温菌株

李 艾，李云凯，程 磊

（唐山学院 环境与化学工程系，河北 唐山063000）

乙醇（俗称酒精）是一种绿色燃料，具有污染小、可再生、容易运输和储藏等优点［1］。乙醇主要来源于粮食和糖料作物，通过微生物发酵把其中的淀粉或糖转化而得。发酵主要由酵母菌引起。酵母发酵温度一般不应超过36℃，温度过高，会导致酵母的老化或死亡，使发酵过程不能正常进行。因此在发酵生产酒精过程中往往需要有冷却这一工序，其目的在于使主发酵的基质维持在一个适宜温度，保证较高的酵母活性以便获得较高的产酒率。假如能使主发酵基质的温度维持在38℃到40℃之间，那么既可以节省能源，又能在我国夏季高温时节进行正常的酒精发酵［2］。此外，酒精生产时糖化酶的最适温度为60℃，若提高了发酵温度，不仅可减少冷却水的用量、使酶活力上升而且单位时间内可发酵性糖的转化率提高，发酵周期也会有所缩短。因此，筛选耐高温、产酒性能好的菌株是很必要的［3］。

本文以实验室保存的酿酒酵母菌株为初始菌株，对其进行紫外诱变，筛选一株耐高温、产酒率高的菌株，并进一步探讨其发酵特性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

菌株：酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保存中心，实验室4℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母生长曲线的测定方法

采用紫外分光光度法测定菌株（酿酒酵母）浓度。首先利用紫外分光光度计在560nm处以空白试剂作参比测得酿酒酵母OD（光密度）值。在一定范围内，菌体的浓度和所测得的光密度或浊度呈线性关系。因此，定时测定培养液的OD值，然后以OD值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制出酿酒酵母生长曲线。

1.2.2 酿酒酵母紫外诱变方法

采用单一诱变剂（紫外线）照射酿酒酵母，设定紫外灯功率10W，照射距离30cm，改变照射时间，筛选出耐高温、产酒精高的菌株。

2 实验结果与分析

2.1 酿酒酵母生长曲线

取酿酒酵母斜面菌种1支，无菌操作接入YEPD培养液中，在30℃下恒温培养24h，制成种子培养液。用2mL无菌移液管准确吸取2mL种子培养液加入三角瓶中，于30℃下振荡培养。然后分别对培养时间为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h的培养液测定OD值。酿酒酵母生长曲线见图1。

图1 酿酒酵母生长曲线

由图1可明显观察到酿酒酵母菌体细胞生长出现3个阶段：延滞期、对数期、稳定期。生长曲线直观地反映了该菌群在培养过程中的生长、繁殖规律，该菌群在培养0～3h为延滞期，3～10h为对数生长期，10～16h为稳定期。

在对数生长期，酵母菌活菌数目以稳定的几何指数增长。此期间菌落形态、生物活性、染色都很典型，对环境因素的作用很敏感，因此选择本实验的紫外诱变在此期间进行。

在稳定期，生长菌群总数处于基本平稳阶段，但细胞群体活力变化很大。由于培养基中营养物质的不断消耗、pH值下降、毒性产物积累等不利因素的影响，菌落染色、形态、生物活性出现改变，菌体开始产生代谢产物，有利于发酵产物的积累。

2.2 酿酒酵母的诱变

2.2.1 菌悬液的制备

取已培养的24h的活化酿酒酵母斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，倒入试管中强烈振荡10min，打碎菌块，离心（1 000r／min）5min，弃上清液，将菌体用无菌水重复洗涤2次，最后制成菌悬液，使用XB－K－25型的血球计数板在显微镜下对酵母菌的细胞数进行测定，并调整细胞浓度为107～108个／mL。血球计数板（规格25×16）测定酵母菌细胞数的计算公式为

2.2．2 诱变

取菌悬液加入到6cm培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒在距离10W紫外灯30cm处边照射边搅拌。诱变时间分别为2min，3min。关闭紫外灯，在黑暗中放置5min。

2.2.3 培养

取诱变后的菌悬液1mL用生理盐水稀释10倍，取2．5mL进行涂板。将紫外诱变后的酿酒酵母菌株和初始酿酒酵母菌株分别在35℃，37℃，40℃条件下进行培养，其长势情况见表1。

表1 初始菌株和诱变菌株不同培养温度下的生长情况

由表1可知初始酿酒酵母菌株在35℃，37℃条件下长势明显变弱，在40℃的高温下无菌落长出，说明高温破坏了菌体酶的活性，不利于菌株的生长。经紫外诱变的菌株在35℃，37℃条件下长势明显好于初始菌株，且诱变3min的长势明显优于诱变2min的长势，说明诱变时间长，菌株的致死率相对较高，产生的变异效果明显。

2.3 酿酒酵母的发酵实验与酒精含量测定

2.3.1 酿酒酵母发酵实验

在无菌操作台内用接种环分别挑两环初始菌株、诱变2min的菌株和诱变3min的菌株至YEPD培养基中，分别放入温度为35℃，37℃，40℃培养箱中先120r／min的振荡培养18h，后静置培养54h。

2.3.2 酒精度测定

取以上各发酵液150mL，加入少量沸石进行蒸馏，收集馏出液。用酒精计测定其酒精度。将菌株进行编号，字母A代表诱变时间为2min的菌株，B代表诱变时间为3min的菌株，阿拉伯数字1代表35℃，2代表37℃，3代表40℃。酒精度的测定结果见表2。

表2 初始菌株及诱变菌株发酵酒精度的测定

由表2可知初始菌株，在35℃和37℃高温条件下其发酵能力明显下降。而诱变时间3min，诱变温度37℃的菌株发酵能力最强，其成熟醪酒精的体积分数可达3．837%；诱变时间3min，诱变温度为35℃的菌株发酵能力次之，其成熟醪酒精的体积分数为3．571%。结果表明，酿酒酵母经诱变3min可适应37℃的较高温度，且具有较高的产酒率，故B2菌株为本实验筛选目的菌株。因此，通过紫外诱变成功选育出了一株耐高温、高酒精产率的酿酒酵母菌株。

3 结论

本实验采用紫外诱变方法，诱变筛选耐高温、高产酒率的酿酒酵母。该方法简单易行，且有较高的诱变效率。利用紫外分光光度法测定菌株浓度，绘制出酿酒酵母生长曲线，由此选择了最佳的菌株诱变菌龄为3～10h，以此提高诱变得率。紫外线诱变的条件为：紫外灯功率10W；照射距离30 cm，照射时间3min。此条件下筛选出了一株耐37℃高温，酒精产率为3．837%的酿酒酵母菌株。

［1］ 章克昌．发展“燃料酒精”的建议［J］．中国工程科学，2002，2（6）：89－93．

［2］ 马晓建，孙凤杰，刘龙飞．降低燃料乙醇生产成本若干问题的分析［J］．河南化工，2003（9）：4－7．

［3］ 池振明．高浓度酒精发酵技术的研究进展［J］．食品与发酵工业，1995（4）：80－85．