HPLC-ELSD同时测定丹参注射液中4种糖类成分的含量△

黄利，葛婷，夏蕴琼，杨锦强，郑云枫*，朱立静，刘将

(1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210029；2.上海华源安徽锦辉制药有限公司，安徽 阜阳 236018)

HPLC-ELSD同时测定丹参注射液中4种糖类成分的含量△

黄利1，葛婷1，夏蕴琼2，杨锦强1，郑云枫1*，朱立静1，刘将2

(1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210029；2.上海华源安徽锦辉制药有限公司，安徽 阜阳 236018)

目的：建立丹参注射液中果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖4种糖类成分的HPLC-ELSD分析测定方法。方法：采用Prevail Carbohydrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-水(67∶33)为流动相，体积流量为1.0 mL·min-1；ELSD漂移管温度90 ℃，载气为空气，载气流量为3.0 L·min-1；柱温为35 ℃。结果：果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖的线性范围分别为375.6～187 8，233.0～116 5，228.4～114 2，300.2～1 501 μg·mL-1，平均回收率分别为102.4%，103.9%，103.1%，100.9%，RSD分别为2.18%，3.45%，2.56%，2.71%。结论：该方法具有准确、重现性好、简便等优点，可用于丹参注射液的质量控制。

HPLC-ELSD；丹参注射液；糖类

丹参注射液是临床常用于治疗冠心病、心绞痛的中药注射剂之一，具有活血化瘀、理气开窍之功效[1]。已有研究表明，丹参注射液中除了含有酚酸类活性成分外，还含有含量较高的单糖及低聚糖类成分[2-5]。糖类化合物虽不是活血化瘀的有效成分，但直接影响着注射液渗透压、固体量等重要参数。因此在控制丹参注射液中酚酸类成分的前提下，应进一步明确其含有的糖类成分含量，以保证其质量可控及制剂安全。为此，课题组在前期研究的基础上，依据国家食品药品监督管理局(SFDA)《中药注射剂安全性再评价》相关要求，采用HPLC-ELSD法建立了同时测定丹参注射液中4种糖类成分的含量测定方法，结果显示本法准确、快速、重现性好，可以用于丹参注射液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 HPLC色谱系统，Alltech ELSD 2000蒸发光散射检测器，HS色谱数据工作站V4.0+(Waters公司)；AE240型电子分析天平(瑞士Mettler)。

1.2 试药

果糖(批号：100231-200303)、葡萄糖对照品(批号：110833-200904)均购自中国食品药品检定研究院，甘露三糖对照品(批号：021654)、水苏糖对照品(批号：851787)购自Sigma-Aldrich公司。乙腈为色谱纯，水为亚沸蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

丹参注射液为市售品(江西桔都药业有限公司，批号：100114，规格：10 mL/支；江苏神龙药业有限公司，批号：090710，规格：2 mL/支；正大青春宝药业有限公司，批号：091293，规格：10 mL/支)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(250mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相：乙腈(A)-水(B)(67∶33)，进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1，ELSD漂移管温度：90 ℃，载气为空气，载气流量：3.0 L·min-1，柱温：35 ℃。对照品及样品色谱图见图1。

A.江苏神龙药业；B.江西桔都药业 C.正大青春宝药业；D.混合对照品1.果糖 2.葡萄糖 3.甘露三糖 4.水苏糖图1 不同企业产丹参注射液中糖类成分的HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖对照品46.95，29.13，28.55，37.53 mg置25 mL量瓶中，用水溶解并加水至刻度，摇匀，制成每1 mL分别含果糖1.878 mg、葡萄糖1.165 mg、甘露三糖1.142 mg及水苏糖1.501 mg的混合对照品储备溶液。分别准确移取混合对照品储备溶液1.0，2.0，3.0，4.0 mL于5 mL量瓶中，用水稀释配制成不同浓度的系列混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取丹参注射液1 mL置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取5种系列混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积对数值(Y)对质量浓度(μg·mL-1)对数值(X)进行线性回归，得回归方程。以各对照品信噪比10∶1确定定量限(LOQ)，信噪比3∶1确定检测限(LOD)，结果见表1，表明各糖类化合物在试验质量浓度范围内线性关系良好。

表1 4种糖类化合物的线性回归方程、定量限和检测限

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，重复进样6次，果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖峰面积的RSD分别为1.78%，2.42%，1.94%，1.47%，说明该方法的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液分别在0，2，4，6，8，12 h进样分析，果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖峰面积的RSD分别为1.24%，1.84%，1.93%，1.60%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号丹参注射液6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进行测定，测得果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖含量的RSD分别为2.18%，1.98%，2.45%，1.95%。说明该方法的重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取丹参注射液，精密量取0.5 mL，共6份，2份为一组，按相当于样品含量的80%，100%，120%，分别精密加入上述4种对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件分别进行测定，计算回收率。果糖的平均回收率为102.4%(RSD=2.18%)；葡萄糖的平均回收率为103.9%(RSD=3.45%)；甘露三糖的平均回收率为103.1%(RSD=2.56%)，水苏糖的平均回收率为100.9%(RSD=2.71%)。

2.9 样品测定

取3个批次不同企业生产的丹参注射液，每个批次取样2份，分别按2.3项下供试品溶液制备方法制备，得供试品溶液。并按2.1项下色谱条件分别测定4种糖类成分含量，结果见表2。

表2 不同企业生产丹参注射液中4种糖类成分含量测定结果 /mg·mL-1

3 讨论

在检测器参数的优化方面，漂移管温度及气体流量是影响蒸发光散射检测器检测色谱峰信噪比的主要因素，经过优选最终确定了漂移管温度为90 ℃，载气流量为3.0 L·min-1。

在流动相系统选择方面，分别采用甲醇-水、乙腈-水等溶剂洗脱，考察样品中各成分的分离情况及检测灵敏度，经过反复试验，结果表明采用乙腈-水(67∶33)洗脱时，所测4种糖类成分色谱峰峰形、柱效和分离度均良好。

从实验结果来看，不同企业生产的丹参注射液中所含4种糖类成分含量差异较大，正大青春宝药业生产的丹参注射液中未能检测到甘露三糖及水苏糖成分，而另外两个企业生产制剂中均能测到这4种成分。有文献报道[6]，丹参中并不含有甘露三糖，其制剂中所含甘露三糖主要由水苏糖转化而来。据此我们推测，不同企业制剂中所含糖类成分差异的原因可能与其所用原药来源及生产工艺不同有关。糖类成分虽不是丹参注射液发挥治疗作用的有效成分，但该类成分的含量可部分反映其原料及生产工艺的状况。因此，通过对丹参注射液中糖类成分的测定，将有助于其所使用原料及生产工艺的监控，进而保证其临床应用的安全有效。

[1] 张志华.丹参滴注液治疗短暂性脑缺血发作64例疗效分析[J].西部医学，2004，16(1)：58.

[2] 何丽娜，杨军，姜怡，等.丹参酮对培养PC12细胞损伤模型的保护作用[J].中国中药杂志，2001，26(6)：413.

[3] 李婧，刘汉清，孙小芬.丹参注射液多成分定量测定和指纹图谱研究[J].中成药，2011，33(4)：553.

[4] 尹爱群，刘群，邱明丰.不同厂家复方丹参片中丹参酮ⅡA的含量测定[J].中国中药杂志，2006，31(20)：1729.

[5] 刘陶世，黄耀洲.丹参成分、制剂和质量控制研究概况[J].南京中医药大学学报，1998，14(4)：255.

[6] 郑云枫，彭国平，程建明，等.丹参注射液中糖类化学成分及在生产工艺条件下的转化[J].中成药，2012，34(11)：2155.

DeterminationofFourSaccharidesinDanshenInjectionbyHPLC-ELSD

HUANG Li1, GE Ting1, XIA Xun-qiong2, YANG Jin-qiang1, ZHENG Yun-feng1*, ZHU Li-jing1, LIU Jiang2

(1.SchoolofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210029,China; 2.ShanghaiHuayuanAnhuiJinhuiPharmaceuticalCo.Ltd.,Fuyang236018,China)

Objective：To establish a simple and sensitive high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light-scattering detector(HPLC-ELSD)method for the determination of four saccharides including fructose，glucose，mannotriose and stachyose in Danshen Injection.Methods：The HPLC method was conducted on a Prevail Carbohydrate ES column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-water(67∶33)as mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1，the drift tube temperature of ELSD was set at 35 ℃，and carrier flow was 3.0 L·min-1. The column temperature was 35℃.Results：The calibration of fructose，glucose，mannotriose and stachyose were linear over the ranges of 375.6～187 8，233.0～116 5，228.4～114 2 and 300.2～150 1 μg·mL-1respectively，and the average recoveries were 102.4%(RSD，2.18%)，103.9%(RSD，3.45%)，103.1%(RSD，2.56%)，100.9%(RSD，2.71%)respectively.Conclusion：The method is accurate，simple and reproducible for quality control of Danshen Injection.

HPLC-ELSD； Danshen Injection； Saccharides

2013-03-12)

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江苏省自然科学基金项目(SBK201123752),南京中医药大学科技创新风险基金项目(CX201101)

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郑云枫，Tel：(025)86798186；E-mail：zyunfeng88@126.com