DM-130大孔吸附树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究

汪杰，曹骋

(1.海南省三亚市中医院，海南 三亚 572000；2.广州中医药大学，广东 广州 510006)

中药工业

DM-130大孔吸附树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究

汪杰1，曹骋2*

(1.海南省三亚市中医院，海南 三亚 572000；2.广州中医药大学，广东 广州 510006)

目的：研究DM-130型大孔树脂对何首乌二苯乙烯苷的吸附性能及分离纯化工艺参数。方法：采用HPLC测定二苯乙烯苷含量，计算DM-130大孔树脂对二苯乙烯苷的吸附率和解吸率。结果：最佳工艺参数为上样液浓度0.2 mg·mL-1(相当于生药量)，上样量为2.5 BV，洗脱剂为70%乙醇，洗脱剂用量为3 BV。结论：DM-130大孔树脂对何首乌二苯乙烯苷的纯化效果较好，研究结果可为实际生产提供理论依据。

何首乌；二苯乙烯苷；DM-130大孔吸附树脂

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonumMultiflorlumThunb.的干燥块根，具有补肝、益肾、养血、祛风之功效，能解毒，消痈，截虐，润肠通便。用于疮痈，瘰疬，风疹瘙痒，久虐体虚，肠燥便秘[1]。何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类、糖类等成分。二苯乙烯苷具有抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防治动脉硬化及保肝等作用[2]。大孔吸附树脂吸附分离技术是一种纯化新工艺，可以用于分离、富集中药有效部位或有效成分[3-4]。DM-130大孔吸附树脂是一种弱极性树脂，适合分离弱极性及中等极性中药成分[5]。为了更好地分离纯化何首乌中二苯乙烯苷，发挥何首乌的药效，作者主要研究考察DM-130树脂对何首乌二苯乙烯苷的吸附性能及工艺参数，旨在寻找出最适宜的动态吸附工艺，为实际生产提供理论依据。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT高效液相色谱仪；检测器：SPD-10Av；色谱柱：Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；何首乌药材(广州致信中药饮片有限公司)；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(中国食品药品检定研究院，批号：110844-200606)；DM-130型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)；乙腈为色谱纯(科密欧)，水为蒸馏水，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 何首乌上样液的制备

称取何首乌药材粉末(过二号筛)适量，置圆底烧瓶中，加10倍体积50%乙醇，置恒温水浴锅中加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至无醇味，高速离心(3 000 r·min-1)，取上清液，加50%乙醇调节溶液浓度至0.2 g·mL-1(相当于生药量)。

2.2 二苯乙烯苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 流动相：乙腈-水(25∶75)；检测波长：320 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL·min-1，进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加50%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取何首乌上样液(或流出液)1 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，过微孔滤膜，滤过，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 mL置5 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜。分别进样测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得线性方程Y=1 165 463 492X+607 235，r=0.999 6。结果表明2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样浓度在0. 2～1.6 μg·mL-1线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6次，按2.2.1项下色谱条件测定二苯乙烯苷峰面积，结果峰面积的RSD=0.2%，表明该测定方法精密度良好。

2.2.6 加样回收试验 取同一已知准确含量的供试品溶液6份，各精密加入二苯乙烯苷对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定二苯乙烯苷峰面积，计算二苯乙烯苷含量，计算回收率。测得平均加样回收率为104.1%，RSD=2.6%。说明该测定方法准确可靠。

2.2.7 含量测定 按2.2.1及2.2.3项下方法，分别进样测定二苯乙烯苷峰面积，按标准曲线法计算含量。

2.3 动态吸附性能考察

2.3.1 大孔树脂预处理[6]取DM-130大孔吸附树脂适量，加乙醇浸泡3～5 d，待其充分溶胀后，用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗尽乙醇。

2.3.2上样液浓度影响 称取已经预处理的DM-130大孔树脂5 g，共5份，装柱，另取浓度为0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g·mL-1(相当于生药量)的上样液10 mL，上样，待吸附完全后，按2.2.6项下方法测定流出液中二苯乙烯苷含量，计算吸附率。结果见图1。

图1 上样液浓度对DM-130型大孔树脂吸附率的影响

由图1可以看出，上样液浓度为0.15 g·mL-1(相当于生药量)时，DM-130树脂对二苯乙烯苷的吸附率达到最大，此后呈逐渐下降趋势，但上样液浓度为0.2 g·mL-1(相当于生药量)时的吸附率与0.15 g·mL-1(相当于生药量)时吸附率相比，两者相差不大，从节省上样时间角度考虑，故选择上样液浓度0.2 g·mL-1(相当于生药量)较为适宜。

2.3.3 最大上样量的确定 称取已经预处理的DM-130树脂10 g，装柱，另取浓度为0.2 g·mL-1(相当于生药量)的上样液，上样，分段收集流出液，按2.2.6项下方法测定二苯乙烯苷含量，计算未吸附率。以药液体积为横坐标，未吸附率为纵坐标绘制泄漏曲线。结果见图2。

图2 最大上样量考察

由图2可知，开始时，随着上样液增加，未吸附率逐渐增加，2.5 BV后未吸附率显著上升，此时二苯乙烯苷大量泄漏，树脂对二苯乙烯苷的吸附能力显著下降，故确定2.5 BV为最大上样量，此时未吸附率未超过10%。

2.3.4 乙醇浓度考察 取DM-130树脂10 g，装柱，用上样液吸附饱和，用水洗至流出液无色澄清后，依次以3倍柱体积30%，50%，70%，95%乙醇洗脱，按BV收集各段洗脱液。按2.2.6项下方法测定各段洗脱液中二苯乙烯苷含量，结果见图3。

图3 洗脱液浓度的影响

由图3可得，随着乙醇体积分数的增加，洗脱液中二苯乙烯苷的含量逐渐增加；当乙醇体积分数大于70%后，洗脱液中二苯乙烯苷含量增加不明显，故确定洗脱液乙醇浓度为70%。

2.3.5 洗脱曲线 取已吸附饱和树脂10 g，用蒸馏水洗脱除去水溶性杂质，再以2 BV·h-1的流速和70%乙醇洗脱，按BV收集洗脱液。按2.2.6项下方法测定各段洗脱液中二苯乙烯苷含量，绘制动态解吸曲线，结果见图4。

图4 洗脱剂用量考察

由图4可知，流脱液中二苯乙烯苷的量随着洗脱剂体积的增大而逐渐减少，到第3BV时，二苯乙烯苷含量已经很少，可认为二苯乙烯苷已基本洗脱完全，故确定洗脱剂用量为3 BV。

2.3.6 验证实验 取DM-130树脂10 g，上柱，按优选出的最佳工艺参数上样洗脱，即：上样液浓度0.2 mg·mL-1(相当于生药量)，上样量为2.5 BV，洗脱剂为70%乙醇，洗脱剂用量为3 BV。按2.2.6项下方法测定二苯乙烯苷含量，计算洗脱率。结果见表1。

表1 验证实验结果

由验证实验结果可以看出，按选出的最优工艺进行吸附与洗脱效果较好，平均吸附率、洗脱率分别达到83.2%和84.6%。

3 结果与讨论

DM-130大孔吸附树脂是一种弱极性树脂，适合分离纯化弱极性和中等极性有机化合物。二苯乙烯苷类化合物多含有酚羟基,可作为良好的氢键供体,有利于被极性树脂吸附。实验表明DM-130型树脂对二苯乙烯苷类化合物具有较强的富集能力。实验研究初步确定DM-130大孔树脂对何首乌二苯乙烯苷纯化条件为：上样液浓度0.2 mg·mL-1(相当于生药量)，上样量为2.5 BV，洗脱剂为70%乙醇，洗脱剂用量为3 BV。验证实验证明，DM-130树脂对何首乌二苯乙烯苷的动态吸附率、解吸率均在80%以上，纯化效果良好。纯化后二苯乙烯苷在干膏中的含量由6.9%提高至38.2%，表明DM-130树脂纯化何首乌二苯乙烯苷的工艺稳定，方法可取,具有良好的应用前景。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：164-165.

[2] 王文静，薛咏梅，赵荣华，等. 何首乌的化学成分和药理作用研究进展[J]. 云南中医学院学报,2007,30(3)：60-64.

[3] 郭丽冰，王蕾. 常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情况[J].中国现代中药,2006,8(4)：31.

[4] 何伟，李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用[J].南京中医药大学学报,2005,21(2)：134-136.

[5] 张旭，王锦玉，仝燕，等.大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(6)：286-289.

[6] 胡军，周跃华.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用[J]. 中成药，2002， 24(2)：127.

StudyonPurificationTechnologyofStilbeneGlycosideinPolygonummultiflorumThunb.withDM-130MarcoporousResin

WANG Jie1,CAO Cheng2*

(1.SanyaHospitalofTCM,Sanya572000,China； 2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective： To study the conditions and parameters of purifying 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside inPolygonummultiflorumThunb..Methods： Use HPLC to determine the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside. Calculate the adsorption and Desorption rate.Results： The optimum process condition： solution concentration is 0.2 g·mL-1,the maximum sample volume is 2.5 BV,eluted by 70% 3BV ethanol.Conclusion： Adsorption purification effect of DM-130 marcoporous resin is good. The purification method is advisable,and can provide theoretical basis for practical production.

PolygonummultiflorumThunb.； Stilbene Glycoside； DM-130 marcoporous resin.

2012-12-27)

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曹骋，E-mail：caosir@126.com