于佳佳,陈恺
(1.新疆职业大学烹饪与餐饮管理学院,新疆乌鲁木齐830013;2.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052)
环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质,是生命信息传递的“第二信使”[1]。在体内可以促进心肌细胞的存活,改善心肌缺氧的作用[2]。增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力;促进钙离子向心肌细胞内流动,增强磷酸化作用,促进兴奋-收缩偶联,提高心肌细胞收缩力,增加心输出量;同时还扩张外周血管,降低心脏射血阻抗,减轻心脏前后负荷,增加心排出量,改善心功能[3-4]。对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。红枣中 cAMP 含量高达 100 nmol/g~600 nmol/g[5],是180 多种已测高等植物中含量最高的植物品种。新疆红枣栽培面积近50 万公顷,产量达300 万吨[6]。哈密地区日照时数之长,昼夜温差之大,日照率之高,为新疆乃至全国之最。目前,国外的cAMP 产品主要是从动物的内脏中提取,其成本较高,产量也较少[7-9]。本文以哈密大枣为研究材料,采用大孔树脂对哈密大枣提取液中cAMP 的分离纯化工艺进行研究,为哈密大枣以及其他枣品种的精深加工及综合利用提供理论依据。
哈密大枣:干枣,购于北园春干果市场。cAMP 标准品(纯度≥99%):中国食品药品检定研究院;甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾(优级醇)、无水乙醇(分析纯)、氨水(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯):天津市大茂化学试剂厂;离子交换树脂、D-101、HZ-802、AB-8 型大孔吸附树脂:艾美科健(中国)生物医药有限公司。
高效液相色谱仪:[包括SPD-20A 紫外检测器、LC-20AB 高压恒流泵、CTO-10AS 恒温柱温箱、Brava-BDS C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]:日本岛津公司;SHB-111 循环水式多用真空泵:郑州长城科工贸有限公司;KQ5200 超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;AL204-IC 电子天平、FE20K-Plus pH 计:梅特勒-托利多仪器有限公司;JY2002 电子天平:上海良平仪器仪表有限公司;HH-S 恒温水浴锅:金坛市医疗仪器厂;TDSA-WS 低速离心机:湘仪离心机仪器有限公司;烧瓶、三角瓶、玻璃棒。
1.3.1 分离纯化工艺流程
提取液→大孔吸附树脂吸附→洗脱→真空冷冻干燥→哈密大枣cAMP 粗品
1.3.2 上样液的制备
将哈密大枣去核后,粉碎干燥过60 目筛至恒重,放置干燥器中备用,以1 ∶10(g/mL)的料液比加入蒸馏水,80 ℃水浴加热4 h,过滤后真空浓缩备用。
1.3.3 色谱条件
前期研究结果显示[10],高效液相色谱测定条件为流动相为甲醇∶0.05 mol/L 磷酸二氢钾,体积比=10 ∶90,流速:1.0 mL/min,柱温:30 ℃,进样量:20 μL,检测波长:256 nm。
1.3.4 树脂预处理与活化
分别称取大孔吸附树脂HZ-802(非极性)、D101(非极性)、AB-8(弱极性)、离子交换型树脂各5 g 置于150 mL 三角瓶中,加入50 mL 95%乙醇溶液,进行摇床,条件为 20 ℃、180 r/min,摇床 24 h,使树脂充分活化。取出后滤去乙醇溶液,用4%氢氧化钠浸泡3 h 后用水冲洗至中性,再用2%盐酸浸泡3 h 后用水冲洗至中性后去离子超纯水保存待用[11-12]。
1.3.5 树脂的筛选
取上述活化后洗至中性的4 种树脂,滤去超纯水后各加入50 mL 哈密大枣提取液,进行摇床,条件为20 ℃、180 r/min,摇床 24 h,使其充分进行静态吸附。取上清液,过0.45 nm 滤膜,高效液相色谱测定cAMP 含量[13],计算吸附率。根据测定结果分别计算4 种树脂的静态吸附率和解吸率。计算公式为:
式中:C0为提取液 cAMP 浓度,mg/mL;C1为吸附后溶液中cAMP 浓度,mg/mL;C2为解吸附后溶液中cAMP 浓度,mg/mL。
2.1.1 静态吸附试验
精密量取预处理好的4 种大孔吸附树脂各20.00 g(湿重)置于三角瓶中,加入上样液200 mL,密封,于振荡器(20 ℃,180 r/min)中振荡,使其充分吸附,12 h 取上清液,检测溶液中cAMP 含量,计算其吸附率。试验结果见图1。
图1 不同树脂对哈密大枣cAMP 的静态吸附率Fig.1 Results of static adsorption of different macroporous resins to cAMP from Hami jujube
图1 结果表明,离子交换树脂对cAMP 的吸附效果较差,吸附率仅为7%左右,D101 型和AB-8 型树脂对cAMP 的吸附效果较好,吸附率分别为28.19%和29.95%,HZ-802 型树脂的吸附率在4 种树脂中最高,吸附率为38.64%。
2.1.2 解吸试验
通过吸附试验得知离子交换型树脂的吸附效果差,所以没有对离子交换树脂进行解吸试验。取充分吸附后的3 种树脂,过滤,分别取50 mL 20%乙醇和氨水作为洗脱剂,进行摇床解吸,条件为20 ℃、180 r/min,摇床24 h,使其充分进行解吸,取上清液,过0.45 μm滤膜,高效液相色谱测cAMP 含量,计算解吸率。试验结果见图2。
图2 不同树脂对哈密大枣cAMP 的解吸率Fig.2 Results of static desorption of cAMP from Hami jujube from different macroporous resins
图2 结果表明,通过20%乙醇洗脱剂进行解吸时,HZ-802 型树脂的解吸效果在3 种树脂中最差,解吸率为71.95%。D101 型树脂的解吸率最高,解吸率为85.15%。AB-8 型树脂的解吸率与D101 型相差不大,解吸率为84.55%。3 种树脂使用20%乙醇洗脱剂的洗脱效果均高于氨水洗脱剂,所以选择20%乙醇作为洗脱剂。结合吸附率试验,HZ-802 树脂的吸附效果较好,故选用HZ-802 型树脂吸附,20%乙醇溶液作为洗脱剂进行后续试验。
2.2.1 泄露曲线的研究
泄漏曲线的测定可以确定动态吸附时的上样体积。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择上样液cAMP 浓度15 μg/mL,pH 5,流速1.0 mL/min,进行分管收集,每管收集20 mL,过0.45 nm 滤膜,进高效液相色谱测定cAMP 的浓度。试验结果见图3。
图3 HZ-802 型树脂对哈密大枣cAMP 的吸附泄露曲线Fig.3 Leak curve of HZ-802 resin adsorbing cAMP from Hami jujub
图3 结果表明,当收集到第10 管时,可以测得cAMP 含量为 7.94 μg/mL,且后续收集管 cAMP 含量呈增长趋势,所以确定此点为泄漏点,最大上样体积确定为220 mL。
2.2.2 流速的选择
取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择上样液的流速分别为1、1.5、2、2.5、3 mL/min,上样液 cAMP 浓度 15 μg/mL,pH 5,上样体积为220 mL 进行动态吸附,收集流出液过0.45 μm滤膜,进高效液相色谱测定cAMP 的浓度,计算吸附率。结果见图4。
图4 上样液流速对树脂吸附率的影响Fig.4 Effects of flow rate of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin
图4 结果表明,在低流速时,HZ-802 型树脂对cAMP 的吸附效果较好,可能是由于上样液在柱中时间更长,有利于树脂的充分吸附,流速越慢吸附所需要的时间也越长。流速为1.0 mL/min 时树脂的吸附效果最好,吸附率为97.94%。流速在1.5 mL/min 时的吸附率为96.27%,流速在2.0 mL/min 的吸附率为96.18%,流速在 2.5 mL/min 时,HZ-802 型树脂对 cAMP 的吸附率有明显的下降,吸附率降为92.83 %。流速在3.0 mL/min 时吸附率为89.42%。综合时间、吸附效率考虑,选择上样液流速为2.0 mL/min。
2.2.3 上样液浓度的选择
取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,调节上样液cAMP 浓度分别5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL,上样液 pH 5,上样液流速2.0 mL/min,上样体积为220 mL 进行动态吸附,收集流出液过0.45 nm 滤膜,进高效液相色谱测定cAMP的浓度,计算吸附率。结果见图5。
图5 上样液浓度对树脂吸附率的影响Fig.5 Effects of cAMP concentration of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin
图5 结果表明,低浓度的上样液更容易让HZ-802 型树脂对cAMP 进行吸附,随着上样液浓度的升高,树脂对cAMP 的吸附效果逐渐降低。上样液cAMP浓度在5 μg/mL 时吸附率最大,吸附率为97.77%。上样液浓度在 10、15、20、25 μg/mL4 个浓度吸附率较高且相差不大,吸附率分别为96.77%、96.18%、95.82%、95.85%。当 cAMP 浓度高于 25 μg/mL 时,树脂对cAMP的吸附率则随着上样液中cAMP 浓度的升高而有明显降低,浓度在 30、35、40 μg/mL 时吸附率为 92.69%、91.35%、90.65%。所以选择上样液浓度为25 μg/mL。
2.2.4 上样pH 值选择
取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择大枣提取液的上样pH 值分别为3、4、5、6、7、8,上样液 cAMP 浓度 25 μg/mL,上样液流速2.0 mL/min,上样体积为220 mL 进行动态吸附,收集流出液过0.45 nm 滤膜,进高效液相色谱测定cAMP的浓度,计算吸附率。结果见图6。
图6 上样液pH 值对树脂吸附率的影响Fig.6 Effects of sample solution pH value on adsorption rate of HZ-802 resin
图6 结果表明,pH 值对树脂吸附cAMP 有很大影响,上样pH 3 时不利于树脂对cAMP 的吸附,吸附率最低为81.18%。随着pH 值升高吸附率略有提升,在pH 4、5、6 时的吸附率为 94.98%,95.13%、95.69%。当pH 值继续升高,树脂对cAMP 的吸附率则随着pH 值升高而略有降低,pH 7、8 的吸附率分别为94.32%和93.70%。综上所述,上样pH 值选择为pH 6。通过单因素试验,确定HZ-802 型树脂的吸附条件为上样流速2.0 mL/min,上样浓度 25 μg/mL,上样 pH 6。
2.2.5 正交试验
通过单因素试验确定的条件,进行正交试验。对上样液流速、浓度、pH 值3 个因素,每个因素3 个水平,采用L(933)正交表设计正交试验,见表1。
表1 L9(33)正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of L9(33)orthogonal test
表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Results of L9(33)orthogonal experimental and range analysis
正交试验极差分析得到结果,HZ-802 型树脂吸附cAMP 的最佳因素为上样液流速为2.0 mL/min,上样液浓度20 μg/mL,pH 5,吸附率为98.50%。对此结果进行验证试验,得到结果见表3。
表3 验证试验Table 3 Verification test
验证试验结果证明,通过3 次水平试验验证了正交试验得到的条件为HZ-802 型树脂吸附cAMP 的最佳条件,即上样液流速2.0 mL/min,上样液浓度20 μg/mL,pH 5,吸附率为98.50%。
2.3.1 洗脱曲线
洗脱曲线的测定可以确定动态解析时的洗脱液体积。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min、浓度 20 μg/mL、pH 5,上样体积 220 mL 进行吸附。充分吸附后用洗脱液20%乙醇溶液,洗脱液流速1.0 mL/min 进行洗脱,分管收集,每管收集20 mL,过0.45 μm 滤膜,高效液相色谱测定cAMP 的浓度。试验结果见图7。
图7 洗脱曲线Fig.7 Elution curve of cAMP
图7 结果表明,当收集至第3 管洗脱液时,可以测得cAMP 的含量最高,当收集至第5 管洗脱液时,洗脱液中已经未测到cAMP 含量,所以确定洗脱液用量体积定为120 mL。
2.3.2 洗脱液流速的选择
取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min、浓度 20 μg/mL、pH 5,上样体积 220 mL进行吸附。充分吸附后用洗脱液20%乙醇溶液,以洗脱液流速 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min,洗脱液体积 120 mL进行洗脱,收集洗脱液过0.45 nm 滤膜,进高效液相色谱测定cAMP 含量,计算解吸率。试验结果见图8。
图8 洗脱流速对树脂解吸率的影响Fig.8 Effects of flow rate of eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin
图8 结果表明,洗脱液的流速过高或者过低对解吸都有很大的影响。洗脱液流速1.0 mL/min 时解吸效果较差,解吸率为88.16%。流速过高时可能由于洗脱液下降过快,与树脂没能完全接触,导致没有完全洗脱,所以解吸率低。当洗脱液流速为5.0 mL/min 时,解吸率为88.45 %。洗脱液流速控制在2.0 mL/min 和3.0 mL/min 时解吸效果较好,解吸率为92.59 %和93.25%。故选择洗脱液流速为3.0 mL/min。
2.3.3 洗脱液浓度的选择
取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g,填装入层析柱,选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min,浓度 20 μg/mL,pH 5,上样体积 220 mL 进行吸附。充分吸附后用洗脱液浓度为10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液,洗脱液流速3.0 mL/min,洗脱液体积120 mL 进行洗脱,收集洗脱液过0.45 nm 滤膜,进高效液相色谱测定cAMP 含量,计算解吸率。试验结果见图9。
图9 乙醇浓度对树脂解吸率的影响Fig.9 Effects of ethanol concentration as eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin
图9 结果表明,乙醇浓度的大小对于cAMP 的解析效果有明显影响,随着乙醇浓度的提高分离效果也随之提高,以40%乙醇洗脱效果最佳。乙醇能与水以任意比互溶,乙醇溶液中醇浓度越高,极性越弱,越有利于cAMP 这种弱极性物质的洗脱。当洗脱液为10%乙醇时的解吸效果较差,解吸率为79.01%。而洗脱液为50 %乙醇时的解吸效果也相对较差,解吸率为87.78%。当乙醇浓度为20%、30%、40%时,解吸率随着浓度的升高而略微升高,分别为92.59%、93.47%、97.32%。综上所述,洗脱液为40%乙醇溶液对cAMP 的解吸效果最佳,故选择洗脱液浓度为40%乙醇溶液[14]。
根据上样液浓度与洗脱液浓度计算,得到HZ-802型树脂对cAMP 的纯化倍数为1.76 倍。取大孔吸附树脂纯化后的粗提液,旋转蒸发浓缩后,在-70 ℃冰箱内冷冻过夜,于冷冻干燥机进行干燥,干燥参数为:-20 ℃、12 h→ 0 ℃、6 h→10 ℃、3 h→30 ℃、4 h,得到粗提物粉末。精密称取1 g 粗提物粉末,定容至100 mL容量瓶,过0.45 μm 滤膜,高效液相色谱测定cAMP 含量,计算的粗提物中cAMP 含量为0.10%,试验结果与尤妍等哈密大枣中粗提液纯化干燥后cAMP 含量保持一致[15-17]。
1)试验通过静态吸附解吸试验,筛选出对cAMP吸附和解吸效果最佳的树脂HZ-802。
2)HZ-802 型树脂对哈密大枣cAMP 动态吸附的最佳条件为:上样液流速2.0 mL/min,上样液浓度20 μg/mL,上样液 pH 5,吸附率为 98.50%。
3)HZ-802 型树脂对哈密大枣cAMP 动态解吸的最佳条件为:洗脱剂40%乙醇,洗脱剂流速3.0 mmL/min,洗脱液用量体积为120 mL,解吸率为97.32%。
4)冷冻干燥后粗提物中cAMP 含量为0.10%。