巨噬细胞炎性蛋白1α在小鼠深静脉血栓模型中的表达及其意义＊

刘海平，赵学凌，吴雪梅，李兴国，郑宏宇

（昆明医学院第一附属医院骨科，昆明 650032）

深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）因其并发致命性的肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）及难治性的静脉血栓后遗症（postthrombotic syndrome，PTS）而引起临床、科研的极大关注［1］。在DVT到PTE、PTS过程中，血栓栓子的溶解、再通成为影响DVT预后的决定因素［2］。研究发现，与机体损伤修复过程相似，血栓形成后，单核细胞／巨噬细胞在各种趋化因子的诱导下聚集于血栓形成部位，参与栓子的溶解过程［3-4］。巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflamma-tory protein 1α，MIP-1α）因其较强的趋化单核细胞／巨噬细胞作用而逐渐引起重视［5］。本研究拟在建立小鼠DVT模型的基础上观察血栓形成后MIP-1α的表达及其与血栓溶解的关系，为临床DVT的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 100只昆明种小鼠购买于成都军区昆明总医院医学动物实验中心［动物质量合格证号：SYXK（滇）2005-0008］，体质量18～22g，雌雄不限，适应性喂养1周后造模。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》［6］。Trizol试剂、SYBR＠Premix Ex TaqTMⅡ 试剂盒购买于大连宝生物工程有限公司，MIP-1αELISA试剂盒购于美国RB公司，MIP-1α中和抗体（300μg／mL）购于美国Peprotecch公司，Q／CYAE111-2000显微手术器械购于上海医疗器械有限公司。

1.2 小鼠DVT模型的建立及分组 100只昆明种小鼠随机分为对照组（n=10）和模型组（n=90）。模型组以3%的戊巴比妥钠（1mL／kg）麻醉后，常规消毒铺巾，沿腹中线纵轴切2.0 cm切口，分离皮下组织至腹腔，将腹腔内容物轻轻推向左侧，暴露、分离下腔静脉，结扎可视侧支，神经血管钳钳夹约1.0 cm长的近远端各30s，5-0聚丙烯缝线沿下腔静脉纵轴放置，钳夹段血管中段以4-0的丝线连同静脉管壁及聚丙烯缝线结扎，随后抽出聚丙烯缝线，制造狭窄管腔。逐层闭合切口，术后均未应用任何抗生素，自由进饮食。参照文献［7-8］，将模型组分为2个亚组：DVT组（小鼠不加任何干预，n=45）和DVT＋MIP-1α-Ab组（小鼠造模后予以MIP-1α中和抗体0.5mL持续腹腔注射7d，n=45）；随后各亚组于2、4、8、12、21d5个时间点各取8只小鼠过量麻醉处死，取静脉壁及栓子进行检测。根据文献［9］报道，以血栓栓子的质量／长度比值观察血栓溶解程度。

1.3 实时荧光定量PCR反应 cDNA制备：将小鼠过量麻醉处死后，冰盘上取静脉及血栓组织50～100mg，立即放入Trizol试剂中进行RNA抽提。以260nm及280nm吸光度值计算所获RNA含量及纯度，分装后-80℃保存。逆转录过程按试剂盒说明书操作。PCR引物设计：MIP-1α引物设计根据标准荧光定量PCR引物设计原则，应用Primer 5.0程序设计，引物由上海生工公司合成。见表1。

表1 引物设计

PCR 过程：SYBR＠Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL、MIP-1α／GAPDH 上游引物（10pmol／L）1μL、MIP-1α／GAPDH 下游引物（10pmol／L）1μL、模板cDNA 2μL、dd H2O 8.5μL（总体积25μL）于PCR反应管中，扩增条件如下：（1）95℃3min预变性；（2）95℃20s变性，60℃30s退火延伸，40个循环。

实时荧光定量PCR分析：分别测定每个样品 MIP-1α和GAPDH mRNA的Ct值，每个样品均作复孔以减少操作误差。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。采用相对定量方式表示各样品 MIP-1α的ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。再依据ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt参照基因，计算2-ΔΔCt。当目的基因与内参基因的扩增效率接近时，2-ΔΔCt表示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时监测，根据扩增曲线确定Ct值，利用2-ΔΔCt法计算MIP-1αmRNA相对拷贝数。

1.4 ELISA检测下腔静脉及血栓组织中MIP-1α表达 取10 g静脉及血栓样品匀浆化，称取3g匀浆化组织样品，转至玻管中，加6mL乙酸乙酯充分混合10min，2 000r／min离心10 min，随后4mL乙酸乙酯加入玻管中，在50℃温和氮流下蒸发掉乙酸乙酯。将残留物溶于1mL正己烷中，再加入1mL稀释缓冲液，涡旋混合1min，2 000～3 000r／min离心10min，如上层发生乳化，可将试管50℃水浴5min后再次3 000r／min离心，移取50μL（2g组织／mL）用于检测。

1.5 统计学处理 实验重复检测3次，使用SPSS11.5统计学软件进行统计学分析，计量资料采用表示，两组间比较采用t检验，多组组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验动物一般状况 模型组有1只小鼠因严重感染死亡，89只用于实验。所有小鼠于建模后2d解剖观察，模型组造模段静脉均有血栓形成，管壁暗红，轻压不瘪。

2.2 实时荧光定量PCR及ELISA检测结果 结果显示，DVT组MIP-1αmRNA、蛋白随时间点的改变呈逐渐升高趋势，8d升至最高点（P＜0.05），后呈逐渐下降趋势，DVT＋MIP-1α-Ab组 MIP-1αmRNA、蛋白表达亦呈上述趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），相同时间点DVT组 MIP-1αmRNA、蛋白变化较为明显（P＜0.05）。见图1。

图1 各亚组不同时间点MIP-1αmRNA及蛋白的相对表达

2.3 血栓栓子质量／长度比值 造模后各亚组于2、4、8、12、21d5个时间点分别处死8只小鼠，切取造模段血管，结果显示DVT组及DVT＋MIP-1α-Ab组栓子质量／长度比值随时间的延长呈逐渐缩小的趋势（P＜0.05），相同时间点DVT组血栓栓子质量／长度比值减小更为明显（P＜0.05）。见图2。

图2 各亚组不同时间点血栓质量／长度比值

3 讨 论

小鼠DVT模型的建立及血栓溶解规律DVT因其较高的发病率、病死率深受外科领域的关注［10］。在本研究中，参照文献报道由神经血管钳钳夹联合结扎下腔静脉建立小鼠DVT模型，符合静脉内皮细胞损伤及静脉血流淤滞的条件。在实验中作者观察到建模后小鼠DVT在2d内形成，提示在急性静脉内皮细胞损伤及静脉血流淤滞的条件下，2d内机体对损伤处于强烈应激状态，这种强烈反应状态易诱发病理性血栓形成过程；在本次研究中，模型组小鼠于血栓形成后栓子随时间的延长而呈逐渐缩小的趋势，2周后栓子基本无变化，这与文献报道相一致［11］。

研究发现，DVT的溶解、机化、再通过程取决于3个因素：局部静脉微环境中纤溶系统的激活，静脉壁、血栓栓子中基质金属蛋白酶系统的活性，血栓栓子中血管新生情况［12］。现已得到共识：DVT形成及溶解、机化、再通是一个炎症及免疫反应参与的过程，与机体组织的损伤修复过程类似，DVT的溶解、机化、再通过程伴随着中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的活化、迁移、浸润，表达各种细胞因子如IL-1β、TNF-γ等，这些炎性／免疫细胞因子可活化影响血栓栓子溶解、再通的下游调控基因u-PA、MMPs等，从而促进血栓栓子的溶解、再通［13-14］。

MIP-1α是趋化因子C-C家族成员，主要由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、成纤维细胞产生，局部组织中产生的MIP-lα能特异性地趋化淋巴细胞、单核细胞向炎症、损伤部位迁移，促进损伤部位的自我修复过程［15］。Chen等［16］在大鼠DVT模型造模后腹腔注射rh G-CSF后发现，血栓栓子中MIP-1α、MCP-1在栓子中呈逐渐升高趋势，同时单核细胞、巨噬细胞在术后3d显著升高，与血栓栓子缩小程度相一致，这提示MIP-1α在DVT溶解中起重要作用。

在本研究中作者观察到，DVT组造模段静脉及其血栓栓子中的MIP-1αmRNA、蛋白随时间点的改变呈逐渐升高趋势，8d升至最高点（P＜0.05），后呈逐渐下降趋势；同时，血栓栓子的质量／长度比值亦随时间点的改变而呈逐渐缩小趋势；在应用 MIP-1α中和抗体腹腔注射后，DVT＋MIP-1α-Ab组MIP-1αmRNA、蛋白表达虽呈上述趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；相同时间点DVT组血栓栓子质量／长度比值减小较DVT＋MIP-1α-Ab组更为明显（P＜0.05）。提示 MIP-1α在DVT形成后参与了栓子的溶解过程，MIP-1α中和抗体可阻滞其溶解血栓的作用。

值得注意的是，在血栓形成后 MIP-1αmRNA、蛋白的表达在8d左右达到高峰，而栓子的质量／长度比值呈逐渐下降的趋势，这提示在血栓栓子溶解过程中还有其他参与因素，MIP-1α的作用主要表现在血栓形成后2周内。分析后作者认为，在血栓形成后，局部静脉微环境处于损伤应激状态，此时中性粒细胞／巨噬细胞在MIP-1α等趋化因子的诱导下迁徙到血栓形成部位，参与局部静脉的损伤修复；在1～2周后，栓子的溶解、缩小主要为血栓再通作用引起。

在本研究中作者通过建立小鼠下腔静脉DVT模型观察MIP-1α与血栓溶解之间的关系，进而应用MIP-1α中和抗体明确其促进血栓溶解的作用；在实验中未能进一步明确其促进血栓溶解的确切机制，有待于下一步研究。

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