ERa、cyclinD1在人甲状腺乳头状癌组织中的表达及意义＊

司海燕，程晓明，孔凡立，曾 峰，李哲远，杨 华，刘华庆

（遵义医学院附属医院：1.甲乳外科；2.病理科，贵州遵义 563003）

甲状腺癌是内分泌系统中发病率最高的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）的发病率已经超过了总体甲状腺癌的年均增长幅度［1］。PTC占甲状腺癌病理类型的60%～70%，大多发展缓慢并且预后良好［2］，十年的生存率在95%以上［3］，但也有部分PTC很快出现局部侵犯并发生转移。Chen等［4］报道，PTC中的柱状细胞变型，部分生物学行为会表现出差分化和未分化癌的恶性程度高、转移性强的特性。肿瘤直径小于或等于1.0cm的甲状腺微小癌早期也极易发生区域性淋巴结转移［5］。因此，研究PTC的发病机制，通过特征性肿瘤标志物评估患者的预后和识别肿瘤的高复发风险，在PTC的治疗中尤为重要。

甲状腺癌女性发病率为男性的3倍，在青春期后、绝经期前雌激素分泌旺盛时期这种性别差异尤为明显，尽管机制尚未证实，但有学者推测雌激素在PTC的发病机制中发挥重要作用［6］。细胞周期蛋白D1（cyclinD1）是细胞周期蛋白家族的重要成员，细胞周期核心调控因子的异常可能导致细胞周期G1期缩短，造成细胞周期调控失常和细胞异常增殖而形成肿瘤。本文通过研究PTC中雌激素受体a亚型（ERa）和cyclinD1的表达，探讨两者在PTC中表达的意义，为PTC的治疗及判断预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集贵州省遵义医学院附属医院甲状腺乳腺外科2005年1月至2011年3月经病理确诊为PTC 48例，男8例，女40例；年龄10～73岁，平均42.2岁，大于或等于45岁11例，小于45岁37例；有颈淋巴结转移者（颈清标本病理证实）28例，无淋巴结转移者20例；甲状腺癌原发灶肿瘤有包膜侵犯（以术中所见及病理证实为依据）31例，无包膜侵犯者17例，患者术前未行放射、化学治疗。同期设甲状腺良性病变旁正常甲状腺组织30例、甲状腺良性病变69例（甲状腺滤泡性腺瘤28例，慢性淋巴细胞性甲状腺炎6例，结节性甲状腺肿34例，甲状腺嗜酸细胞瘤1例）。用已知ERa、cyclinD1表达的乳腺癌组织作为阳性对照，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 兔抗人ERa单克隆抗体、兔抗人cyclinD1单克隆抗体、Envision检测试剂盒均购自上海基因公司。

1.2.2 免疫组织化学方法 采用Envision免疫组化法测定cyclinD1和ERa。实验步骤如下：（1）石蜡切片4μm，常规脱蜡至水洗；（2）3%H2O210min，水洗；（3）pH6.0的柠檬酸盐高压修复，冷却后PBS冲洗3次×5min；（4）加一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次×5min；（5）加Envision二抗37℃30min，PBS冲洗3次×5min；（6）DAB显色，水洗；（7）苏木精对比染色，脱水，透明，封固。

1.3 结果评定 ERa和cyclinD1阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞核。免疫组化结果判定是根据阳性细胞比例，见参考文献［7］，400倍显微镜下任意5个高倍镜视野里阳性细胞数小于5%为阴性，5%～15%为＋，＞15%～40%为＋＋，＞40%～60%为＋＋＋，＞60%为＋＋＋＋。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件包对各数据进行统计学分析。样本率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ERa、cyclinD1在各组中的表达 ERa在各组中均有表达，表达主要定位细胞核，为棕黄色颗粒，在PTC中的表达见图1A。由表1可见，在PTC中ERa的阳性率为25%（12／48）高于正常甲状腺组织6.7%（2／30）和甲状腺良性病变10.1%（7／69）的阳性率（P＜0.05）。cyclinD1在正常甲状腺组织中无表达，在PTC中79.2%（38／48）的阳性率明显高于甲状腺良性病变中27.5%（19／69）的阳性率（P＜0.05），cyclinD1在PTC中的表达见图1B。

表1 cyclinD1、ERa在正常甲状腺、甲状腺良性病变、甲状腺乳头状癌中的表达

图1 ERa、cyclinD1在PTC中的阳性表达（ICH×400）

表3 ERa、cyclinD1在PTC中表达与临床病理特征的关系

2.2 ERa、cyclinD1与PTC患者临床病理特征的关系 PTC患者淋巴结转移组的cyclinD1阳性率92.9%（26／28）显著高于无淋巴结转移组60%（P＜0.05），PTC肿瘤包膜有侵犯的cyclinD1阳性率90.3%（28／31）显著高于无肿瘤包膜侵犯58.8%（P＜0.05）。ERa表达与PTC患者年龄、性别、淋巴结转移情况、肿瘤包膜有无侵犯等临床病理资料间的关系差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

3.1 雌激素在PTC中的作用 PTC女性患者发病率明显高于男性。本组病例中女性患者人数为男性的5倍，同甲状腺癌的流行病学特征相符。本研究表明ERa的表达在正常甲状腺组织、甲状腺良性病变、PTC中呈现逐渐上升的趋势，推测雌激素可能通过受体作用于PTC细胞，雌激素在PTC的发生、发展过程中起着重要的作用。Rajoria等［8］在体外实验中发现，雌激素可以促进PTC的BCPAP细胞株和正常甲状腺Nthy-ori 3-1细胞株生长，雌激素能够通过β连锁蛋白（β-catenin）增强甲状腺癌细胞的粘连、侵袭和转移。本组PTC中ERa阳性率为25%，与Tavangar等［9］研究ER在PTC中31%的表达率较接近并同其ER的表达与PTC患者的年龄、性别、肿瘤侵犯包膜和颈淋巴结转移状况无关的结果一致。与张璐等［10］报道ER表达与PTC患者性别、肿瘤是否浸润包膜、淋巴结转移状态无关结论相一致，但与患者年龄呈反比的观点有差异。

雌激素有两条途径发挥作用。（1）经典的基因型效应，雌二醇与胞内ER结合后入细胞核，在核内与靶基因的雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）结合后激活其转录。雌激素的代谢产物β-雌二醇可以加快G1期向S期的转化而促进甲状腺癌细胞生长，该作用可被雌激素拮抗剂三苯氧胺所抑制［11］。（2）途径是非基因型效应，雌二醇与其膜性受体结合后，激活细胞内的第2信使系统从而引起相应的生理效应。GPR30是近年发现的一种新型雌激素膜性受体。Wang等［12］研究证实GPR30蛋白通过有丝分裂原活化蛋白激酶信号传导通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK）促进雌激素相关肿瘤生长。氟维斯群（fulvestrant）是一种新型的ER拮抗剂，可以拮抗、阻断、下调ER，但无ER激动作用，体外实验中观察到雌激素能刺激甲状腺癌细胞的黏附、迁移和侵袭，雌激素与甲状腺癌细胞的增殖和转移关系密切，而氟维斯群能直接抑制雌激素的这种作用，有可能为氟维斯群治疗甲状腺癌提供一定的理论依据［8］。

3.2 cyclinD1在PTC中的作用 本研究结果显示，cyclinD1在正常甲状腺组织中无表达，在PTC中的表达（79.2%）远远高于在甲状腺良性病变中的表达（27.5%），表明cyclinD1蛋白与PTC的发生有关。cyclinD1的高表达存在于多种恶性肿瘤组织，提示患者预后欠佳［13］。细胞周期由细胞周期依赖性激酶（cyclin-independent kinase，CDK）控制，cyclinD1是细胞周期的正向调节因子，位于染色体11q23，它对CDK4和CDK6组成的核蛋白进行编码，使之磷酸化和失活视网膜神经胶质瘤蛋白而发挥作用，促进细胞周期从G1期向S期转化，加速细胞细胞周期过程，使细胞无限制增殖［14］，因此cyclinD1的表达变化不仅与肿瘤的发生有关，而且与肿瘤的转移和预后密切相关。Jung等［15］研究发现PTC中cyclinD1的检测有助于识别肿瘤的多灶性和判断甲状腺体内的局部扩散，并且cyclinD1的表达提示肿瘤具有潜在转移的能力。杨晓文等［16］报道，cyclinD1在伴有颈淋巴结转移和原发灶有包膜侵犯的病例中的阳性表达率分别为92.6%和90.3%，明显高于无颈淋巴结转移组 （61.9%）和无包膜侵犯组（58.8%），与本研究结果一致，同样说明cyclinD1的过表达可能提示PTC患者高复发风险和不良预后。Li等［17］通过建立稳定表达cyclinD1反义核酸的肺腺癌A549，应用MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞的凋亡情况，结果显示稳定转染cyclinD1反义核酸后，A549细胞凋亡增加，增殖显著被抑制，机制可能是与pRb、E2F-1、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达降低有关。对cyclinD1蛋白的表达抑制有可能会成为癌症治疗新的途径。

通过本研究，作者认为cyclinD1和ERa表达水平的检测对于PTC诊断具有一定意义。cyclinD1的过表达提示肿瘤的高复发和转移倾向，cyclinD1可以作为独立因子评估PTC转归和预后。对于转移和复发的晚期PTC，针对雌激素受体的抗雌激素治疗有可能发挥独特的作用。若能对PTC中ERa和cyclinD1进行进一步研究，则有可能为临床上甲状腺癌的诊断与治疗提供更多可靠依据。

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